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【动物造模】-艾滋病SIV/SAIDS动物模型的制备方法

  1.通过不同途径创建的动物模型

  艾滋病三种感染方法是通过血液,性别和母婴传播。有两种类型的性传播感染,即同性恋和异性恋。在准备SIV动物模型时,必须首先考虑其实用价值。*好的动物模型可以使人类疾病*大化,包括使用与自然感染相似或相似的方法。通过将SIVmac251接种到上述恒河猴的自然感染的主要方法上,可以创建四种不同感染途径的动物模型:1.在静脉途径的血液感染模型中,病毒是血液中的CD4、 +直接感染T淋巴细胞如果将1m12 x 100000 TCID50的SIVmac251通过静脉缓慢推入猴子体内,它将增加感染中国恒河猴的机会。

  2.异性恋模型通过阴道粘膜上皮传播,该病毒可以直接感染朗格汉斯细胞和上皮细胞。艾滋病灵长类动物模型的研究表明,将黄体酮注射入体内可促进SIV传播,而雌激素则可抑制SIV传播。这些激素可影响阴道壁的厚度,并通过IL-2影响CCR5和CXCR4受体的表达。关系。对于适当的月经周期,或当使用特定量的孕酮时,将1 ml的2×10 7 TCID50 SIVmac251缓慢地导尿入猴子阴道,以建立异性感染的动物模型。去做。  3.相同的感染模型通过直肠粘膜上皮传播,病毒直接感染M细胞和上皮细胞。直肠生理和非常薄的上皮细胞厚度使直肠感染比阴道感染更有可能。为了建立被同性恋感染的动物模型,将1 ml 2x10 7 TCID50 SIVmac251缓慢注入猴子的直肠。在一段时间内进行少量多次感染后(通常为5到8次感染),可以实现100%的感染。

  4.母婴传播模型*近,通过用SIV接种新生恒河猴来建立新生AIDS动物模型。已经观察到与感染HIV的婴儿相似的症状。通过强毒的SIV株,恒河猴的新生儿疾病进展非常迅速,该模型在研究HIV感染婴儿的特征和治疗方面具有实用价值。一些学者发现,在猴子中感染了艾滋病的母亲有天生患有艾滋病的小猴子。这是用于母婴传播的*理想的动物模型,但是其可用性限制了其应用。注意,通过静脉,阴道或直肠感染病毒的效应细胞是不同的。静脉注射直接感染CD4 + T细胞,阴道感染朗格汉斯细胞和上皮细胞,直肠则是M细胞和上皮细胞。直肠和阴道粘膜的结构不同,阴道主要是鳞状细胞,直肠主要是柱状上皮细胞,并且阴道上皮细胞的厚度是直肠上皮细胞的10倍。因为病毒通过各种感染方法暴露于人体的免疫压力,所以各种感染方法对诸如临床症状和病毒学指标等方面具有特定的影响。

  二。 SIV/SAIDS动物模型的制备(1)SIV/SAIDS动物模型的制备方法1.实验病毒感染株为SIVmac251或SIVmac239,病毒储备液的TCID50为2×10。 7功率/毫升2.实验动物是重4至6公斤的SPF恒河猴,以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV),猿猴逆转录病毒D型(SRV-1,2,5)和猿猴T淋巴细胞I型(STLV)以外的病毒。 -1)感染。如果可能,进行动物遗传背景分析。实验前的体格检查正常。动物感染实验应在ABSL-3室进行。

  3. SIVmac251病毒可以通过三种方法接种到恒河猴中:静脉,阴道和直肠。感染量和方法如下:(1)静脉途径。病毒溶液用1 ml溶液按1:100稀释,然后通过阴道途径缓慢注入体内。使用1 ml的病毒原液,将动物置于俯卧位,将病毒溶液缓慢注入阴道边缘,并保持俯卧位30分钟③直肠途径。在动物的俯卧位使用1毫升储备病毒溶液,并在俯卧位缓慢将病毒溶液注入肛门窦30分钟。  4.全血病毒分离4d,7d,10d,14d,21d,28d,以及在接种病毒后的其他有意义的时间点,收集感染了SIV的RIV猴肝素抗凝全血以获得全血。隔离病毒。具体步骤如下:取一个24孔板,并在10%牛血清1640培养基中将全血样品连续稀释5倍。稀释后,每个孔中的*终全血样品体积分别为200μl,40μl,8μl,1.6μl,0.32μl和0.064μl。向每个孔中添加0.4 ml CEMx174细胞,浓度为2x100000/ml,*后用含10%牛血清的1640培养基每孔制备1.6 ml,每3-4天置于37°C,5%CO2培养箱中。贸易。一旦液体。每天连续4周观察CPE。可能发生的*高CPE稀释度是样品的病毒滴度。

  5. PBMC病毒分离是在接种病毒,恒河猴肝素抗凝全血和感染SIV的正常猴后的4、7、10、14、21、28和其他有意义的时间点。收集(没有SIV,STLV)-1、 SRV和B病毒感染)全血用肝素抗凝,PBMC通过密度梯度离心分离,计数并调节至细胞浓度为1 x 1000000/ml。正常猴PBMC用PHA(终浓度5μg/ ml)刺激,SIV感染的猴PBMC用IL-2(终浓度100 U/ml)和PHA(终浓度5μg/ ml)刺激,置于37°C,5%CO2培养箱中。我被带走了。 3d。三天后,将正常猴子和被感染猴子的PBMC分别在24孔板中混合1ml,并交换含有IL-2(25U/ml)和10%牛血清的1640培养基。每天观察细胞形态(CPE)和生长的变化。当细胞数量少且状况不佳时,可以适当补充新鲜,生长良好的正常猴PBMC。每3-4天吸出培养上清液,通过ELISA法测量P27抗原,补充新鲜的1640培养基至终体积1.6ml,并在37℃下在5%CO 2培养箱中继续培养。 ..将细胞培养长达4周。

 6.病毒载量检测SYBR Green?荧光染料实时定量RT-PCR用于确定病毒载量。具体步骤如下:用EDTA抗凝的全血,离心收集上清液,通过TRIzol方法提取病毒RNA,并使用Qiagen的QuantiTect SYBRGreenT-PCR试剂盒,Roche LightCycler 3.5实时PCR仪进行测量。引物:2f(5'-GTAACTATGTCCACCTGCCATTA-3')和2r(5'-CAGCCTCCTCGTTTATGATGT-3'),扩增的片段长度为209bp。反应体系如下:2xQuantiTectSYBRGreenIRT-PCRMasterMix 10μl;引物2f和2r(10μmol/ L)各1μl,终浓度0.5μmol/ L; QuantiTectRTMix 0.2μl;模板1μl; PCR级水6.8μl。反应条件为50°C 20分钟(×1),95°C 10分钟(×1),94°C 15秒(×45),56°C 20秒(×45),72°C 30秒(×45),75确定3°C(×45)°C时的吸光度值。

  7.测量CD4 +/CD8 + T淋巴细胞取50μlEDTA抗凝全血,加入10μlPerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8荧光标记抗体,轻轻混合,并置于室温下在室温下保存15分钟;用1毫升10倍稀释的FACSLysingSouLution溶解红细胞溶解10分钟。用PBS洗涤两次以进行流式细胞术,加入0.5 ml 1%多聚甲醛,在4°C的冰箱中保存,在48小时内机器测试,淋巴细胞中的CD4 +和CD8 + T确定细胞百分比并计算CD4 +/CD8 +比率。  8.血浆抗体测定免疫荧光法(IFA)检测被感染猴子血浆中的抗体水平。用SIVmac251感染CEMx174以制备抗原玻片。首先,将待测样品以1:20的比例稀释,逐渐稀释至1:1280,将其滴在抗原片上,然后在37°C的湿箱中反应30分钟,以完全去除抗原和抗体。允许结合,然后洗涤以除去未结合的血清成分。加入FITC荧光标记的抗猴子IgG抗体,在加湿箱中于37°C孵育30分钟,洗涤,并在荧光镜上观察结果。  9.将细胞免疫测定法(Elispot)在96孔板上预涂抗猴IFN-γ抗体,在4°C放置过夜,然后用含0.05%Tween-20的PBS(PBST)洗涤,加入1%BSA。 200μlPBS在37°C下放置1小时。通过Ficoll密度梯度离心分离猴子PBMC,在无细胞培养基中计算细胞浓度以将其调整为3x1000000/ml,将PBMC添加到封闭的96孔板的孔中,并向每个孔中添加100μl细胞溶液。此外,在5%CO2孵化器中于37°C孵育24小时,向每个孔中添加5g。孵育后,倒出细胞溶液,用200μl冰冷的去离子水处理,用PBST洗涤平板10次,加入生物素化的检测抗体和GABA偶联的抗生物素抗体,然后在37°C孵育。孵育了几个小时。温育后,将板用PBST洗涤5次。随后在室温下加入底物15-20分钟,在显色后,将板用蒸馏水洗涤两次,干燥并在黑暗中保存。使用倒置显微镜和ELISPOT读板器对完成的ELISPOT板进行计数。 10.中和抗体的测定方法是依次稀释待测血清,将稀释的血清与固定量的病毒溶液在37℃下孵育1小时,然后使用中和溶液诱导TZM。 -感染bl细胞并观察感染。以测定血清中和浓度。

  (2)艾滋病SIV/SAIDS动物模型评估标准

  1.临床评估标准实验猴在感染后7至14天出现厌食症,持续超过2周,体重减轻,腹股沟面积减少明显的肿胀保留在浅表淋巴结中。感染后六个月,被感染的猴子表现出食欲大减,体重减轻,腹泻,腹股沟淋巴结减少,体表多次感染,并且动物因疲劳而死亡,尤其是静脉感染。由于动物个体的差异,疾病的严重程度,临床过程和表现可能会有所不同,艾滋病的症状可能不太典型。  2.标准病原学病毒分离结果表明,病毒通常在感染后三天从实验猴全血中分离出来,在感染后10-40天达到*高分离率。发生,然后测量全血中的病毒滴度。它迅速下降并保持较低水平。通过检测血浆病毒载量,感染后三个途径的变化趋势基本相同,感染后迅速上升,在约14天达到10至7拷贝/ ml,并维持约40天然后迅速下降。通常,较早发现静脉感染的猴子病毒,然后在猴子中直肠感染,*后在猴子中阴道感染。急性期后,猴子的病毒载量有一定程度的波动。在急性期可以很容易地检测出病毒GagP27抗原。

  3.免疫学标准

  (1)细胞学变化:实验猴感染后7天CD4 +/CD8 +比率开始下降,并出现逆转..这种现象可以持续很长时间。在整个感染后期间,CD4 +/CD8 +比率波动低于1、 (2)体液免疫力的变化:在感染的猴子中,发现抗体测试在第10-14天呈阳性,抗体滴度在第40-24周逐渐达到顶峰。它上升,然后下降,并继续存在。 (3)细胞免疫力改变:被感染的猴子中的IFN-γ水平反复升高和降低。在感染的早期阶段,实验猴的PBMC中所含的IFN-γ分泌细胞(SFC)的数量很小,并且在感染后30天出现一个小的峰值,并且处于稳定期的实验猴的SFC数量稳定在100左右。在第126天出现另一个高峰,随后是波动期,平均SFC在(100-200)/ 1,000,000 PBMC之间波动。 (4)病理变化:SIV在人体中建立长期慢性感染后,随着疾病的发展,它会影响人体各个系统的功能和形态,*终导致复杂多样的疾病。它可能显示出物理变化。另一方面,艾滋病的形成还涉及对各种系统器官的损害,例如淋巴和造血组织的破坏。对猴SIV感染模型的病理变化进行的观察和研究将有助于了解该模型的病因并进一步评估其实用性。

  3. AIDS SIV/SAIDS恒河猴模型的制备

  SHIV病毒是一种以SIV病毒为骨架并与HIV-1病毒基因重组的人工嵌合病毒。我们将以SIV基因组为背景来表达HIV的内在遗传成分。这克服了HIV和SIV包膜结构和抗原性的主要差异,并克服了使用SIV感染的动物模型评估HIV疫苗和药物的麻烦。病毒种类的差异限制了模型使用和评估的准确性。因此,SIV感染模型是SIV感染模型的主要进步。从理论上讲,猴SIV感染模型目前应该是艾滋病的*佳动物模型,但是这些合成的SIV中的大多数不能像SIV那样引起典型的猴AIDS。当前,国际上已有报道,在已经成功建立了SIV感染动物模型的菌株中含有SIV。 -诸如SF162、SHIV-89.6P,SIV-HXBc2的菌株这些SHIV菌株在猪尾猴中传代后以高水平复制,引起CD4 + T细胞的损失并引起机会性感染。*终你会死。目前,大多数SIV是基于HIV-1B亚型菌株构建的,例如,SIV-89.6是主要由SIVmac239组成并具有HIV-1B亚型的env基因的嵌合病毒。 HIV-189.6是SHIV-89.6的亲本菌株,是具有T淋巴细胞和巨噬细胞嗜性的营养型菌株。表达HIV-189.6 tat,rev,vpu和env基因的SIV-89.6可以感染恒河猴,但不会在猴子中引起类似AIDS的症状。发生了140个碱基的缺失,改变了gp120和gp41膜外区域的12个氨基酸,从而产生了强致病性菌株SIV-89.6P。这种致病性菌株迅速耗尽了CD4 + T淋巴细胞,印度的恒河猴引起了类似AIDS的症状。 SHIV-KB9是SHIV-89.6P的克隆。国外动物研究表明,SIV-KB9是一种成熟的SIV病毒,对印度的猕猴和食蟹猴具有强烈的致病性。近年来,它已在国外广泛用于研究艾滋病的致病机理和评估艾滋病毒疫苗。中国学者还构建了整合了在中国流行的HIV-1B'/ C株的SIV病毒株,并在中国的恒河猴中进行了感染实验,结果表明观察到了病毒血症和淋巴细胞变化。已经证实它可以被有效感染。要建立SIV恒河猴动物模型,必须首先确定SIV感染剂量。如果感染率太低,则恒河猴将不会感染SIV病毒;如果感染率太高,则恒河猴可能会很快死亡。通常,需要滴定实验猴中的病毒浓度以确定感染剂量。eimann等人成功地以400 TCID 50剂量的SIV-HXBc2和SIV-89.6感染了恒河猴。浓度为4.8 x 100000拷贝/ ml或更高的SIV-KB9病毒溶液可以成功感染中国恒河猴。 SHIV还通过三种主要的感染途径。静脉感染,粘膜感染(包括阴道和直肠途径)和母婴传播,分别模拟人类HIV感染的血液,性接触和母婴传播。当前,大多数研究集中于静脉和粘膜途径。静脉感染通常用于研究HIV疫苗和抗HIV药物的作用和机制。常用的SHIV株是SIV-89.6P和SIV-KB9。感染常被用于研究粘膜免疫的机制以及疫苗和药物的作用。常用的菌株是SIV-sfl62P3和SIV-1157i。

  1.建立SHIV/SAIDS动物模型的材料和方法目前,在中国尚没有处于试验阶段的SIV株。 SHIV-89.6P病毒相对成熟,可能由NIH在美国引入。动物恒河猴和其他指标与上述SIV简介相同。

  2. SHIV/SAIDS动物模型中具有不同评估标准的SIV株在感染的实验猴中具有非常不同的临床表现,病毒血症,淋巴细胞变化和疾病水平。动物感染SHIV-89.6P病毒后,会表现出症状和体征,例如神经性厌食症,躁动不安,水样腹泻,体重减轻和体重减轻,甚至死亡。 ELISA方法用于测定实验猴血浆中的P27抗原。在感染后10到14天和病毒分离后7到10天,它变为阳性。血浆病毒载量通常从第7天开始变为阳性,病毒载量从第10天到第21天变为阳性,达到峰值(比第7次方高1.0 x 10拷贝/ ml),此后继续降低。可能会在很长一段时间内将其检测为阳性,或者可能很难检测到。感染前实验猴的CD4 +/CD8 +比率均大于1、并在感染后10至21天逐渐降低并逆转。周期波动,有时会发生逆转和正常轮换。在病毒感染之前,实验猴中CD4 + T细胞的绝对数量超过1000 /μl。感染后,实验猴的CD4 +细胞数量急剧减少,通常在14至21天之间达到*低点,此后保持较低水平,并且波动不稳定。

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