小鼠胚胎,干细胞,体外TE分化 中国实验动物信息网 2022-02-05 1479

　　摘要：胚胎干细胞在体外具有永生增殖，自我更新和多向分化的特征，可以被诱导分化为体内几乎所有细胞类型。该方法主要介绍了小鼠胚胎干细胞的体外EB分化鉴别过程。

　　实验概述

　　该方法主要介绍了小鼠胚胎干细胞的体外EB分化鉴定过程。

　　主要试剂

　　高糖DMEM（Gibco，货号：12800-017粉末），DMEM/F12（Gibco，货号：12500-062粉末），胎牛血清（FBS）（Gibco，货号：16000044） 非必需氨基酸（NEAA）（Gibco，货号：11140050），0.25％（1X）含EDTA4Na的胰酶，液体（Gibco，货号：25200072），明胶（BD，货号：354277），青霉素（SP）（Gibco，货号）。 ：15140122），L-谷氨酰胺（Gibco，货号：25030081），血清替代品（Gibco，货号：10829028）  10％FBS培养液（Gibco，货号10099141） 主要设备  1个超级清洁站

　　2、二氧化碳培养箱（Thermo，catNO.3131）

　　3、6cm培养皿（corning，catNO.430166），10cm培养皿（corning，catNO.430167）

　　4、15ml离心管（corning，catNO.430791） ，50 ml离心管（康宁，货号430829），冷冻保存管（康宁，货号430659）

　　5、直立式显微镜

　　实验步骤

　　①常规细胞消化方法，用粗口吸管吸管只需放入细胞团；

　　②将细胞团转移至6 cm或10 cm培养皿中，并与10％FBS培养基一起孵育（向每个6 cm培养皿中加入5 ml培养基）。

　　③将培养皿置于37℃的二氧化碳培养箱中，进行培养，然后每天取出一次或两次，用粗糙的吸管轻轻摇动或用移液管将细胞悬浮，分离簇，并每天观察；

　　④普通培养切片3天后，细胞团开始分层。外层是内胚层状细胞的大层，而内层细胞小而紧凑。这些是外胚层样细胞和干细胞。这些是简单的胚胎细胞。孵育5-10天。层增加并且出现空洞，并且整个胚胎变成圆形囊泡，胚泡。

　　⑤收集胚泡，提取mRNA，逆转录为cDNA，使用3个胚层引物进行PCR，检测3个胚层基因的表达，确定是否存在3个分化的细菌层。细胞是否具有体外分化为三个胚层细胞的能力。