胚胎心脏功能,脊椎动物模型 中国实验动物信息网 2020-12-11 1121

　　摘要：近年来，斑马鱼已成为心血管研究的强有力的脊椎动物模型。它的优点包括易于遗传操作、透明、体积小、成本低，以及在发育早期无活跃循环的情况下生存的能力。对整个基因组进行测序，并用人类基因组识别正位基因，使得通过遗传途径诱导临床相关的心血管缺陷成为可能。对于这些疾病模型，需要以可靠的方式评估心脏功能和受干扰的血流动力学，以揭示诱导缺陷的机械力学生物学。这项工作需要精确测定发育中心脏内的血流模式和血流动力学应力（即壁剪切应力和压力）水平。传统的方法是利用延时的明视野显微镜来跟踪细胞和组织的运动，但在*近的研究中，快速的光片荧光显微镜被用于这一目的。将更复杂的技术如粒子图像测速和计算流体动力学模型相结合用于血流动力学分析，有助于斑马鱼的研究。我们讨论了斑马鱼胚胎心脏功能和血流动力学分析的*新进展，并总结了我们对斑马鱼心血管系统动力学分析的未来展望。

　　简介：小鼠是已建立的哺乳动物心血管研究模型。敲除小鼠模型使研究许多先天性心脏缺陷（CHD）类型成为可能。胚胎鸡是一种常用的脊椎动物模型，具有类似于人的心脏结构的优点，具有四腔/四瓣结构，能够进行临床相关的手术操作。胚胎斑马鱼*近出现在心血管研究中，用于高通量研究。尽管斑马鱼心脏与人类心脏不同，只是系统循环，但两者的心脏结构和生理学是相似的。斑马鱼胚胎的独特特性使其对心血管研究特别有吸引力。例如，有一些实用的遗传干扰方法，如吗啡寡聚核苷酸注射，以诱导斑马鱼心脏缺陷。这些胚胎是透明的，可以在心脏发育过程中无创成像。在体内，心腔和血管以及血流可以很容易地被观察到。在发育早期，斑马鱼胚胎不依赖于循环系统，因为被动扩散足以供氧。因此，具有严重心脏缺陷的胚胎能够在早期发育中存活，通过这种方法，我们研究了无血流情况下心脏瓣膜的发育情况，这些研究证明了血流动力学对心脏瓣膜发育的重要影响。随着正向和反向遗传学方法的进步，现在有可能在斑马鱼胚胎中诱导各种临床相关的心脏缺陷。在这些动物模型中，需要对血流动力学进行分析，以研究诱导缺陷的机械生物学机制。对于定性和定量的血流动力学分析，有多种显微成像和计算建模方法。这些分析包括确定流型、测量流速、计算心功能参数和计算血流动力学应力水平。

　　斑马鱼心脏发育：在脊椎动物胚胎中形成并开始运作的*个器官是心脏。与双心室哺乳动物心脏不同，成年斑马鱼心脏由一个心室、一个心房、一个房室（AV）瓣膜和一个流出瓣膜组成。脊椎动物之间的遗传途径是保守的，斑马鱼的心脏发育过程与其他脊椎动物相似。*早于前外侧板中胚层受精后5小时（hpf）的心前细胞开始，并继续形成原肠，再形成外胚层、内胚层和中胚层。原肠形成在10 hpf时完成，随后在16 hpf时胚胎中线处的双侧心脏融合。这就形成了一个心锥，然后向前延伸，变成一个线性的心管。线性心导管的外层由收缩肌细胞组成，而内层由心内膜细胞组成。这两层由一层无细胞的细胞外基质层（称为心冻）隔开。在其形成后，24 hpf时线性心导管开始有节奏地蠕动收缩。人类的*次心跳开始于3周，小鼠的*次心跳开始于（e是胚胎发育日）e8.5，鸡的*次心跳开始于（hh是鸡发育期）hh10。随后阶段斑马鱼胚胎的收缩程度可通过高速延时视频显微镜进行量化，以确定心室部分缩短，这是舒张和收缩时心室尺寸的比较。即使在这个阶段没有瓣膜存在，血液仍以250μm/sec的峰值速度泵出，没有明显的回流。不久后，管腔开始开放，每博输出量和心跳迅速上升。在28 hpf时，心跳正常，频率为2.6 Hz。心脏管在33 hpf处呈S形向左转，心室移到心房右侧。在36 hpf时，泵送机制从缓慢的蠕动波转变为连续的心室收缩，提示心脏传导系统的开始。受精后2天，心室室膨胀，内外弯曲明显。在此阶段，心肌细胞开始从心室壁分层，开始形成小梁，到72 hpf时心室有明显的小梁脊。小梁心肌随着心肌壁的显著重塑，以及致密心肌的增殖和传导系统的成熟而向心室腔扩张。遗传学筛选研究揭示了斑马鱼这些早期事件的分子调控。与NKx2.5相关的GATA因子通过限制Wnt信号来控制心肌细胞祖细胞的迁移和心脏的调节。Hand2在心脏分化和形态发生中起作用，而Nkx2.5维持了心脏室的特性。*近，心脏收缩和由此产生的液体力量被证明能够激活Notch信号来调节斑马鱼的心脏小梁。由小叶组成的心脏瓣膜确保斑马鱼单向血流。房室之间的房室管内有一个瓣膜，心室和球动脉之间的流出道内有一个瓣膜。房室瓣膜发育始于心肌中BMP4、TBX2b和VCANA的表达，以及37 hpf时Notch1b、Has2和神经调节蛋白的心内膜表达。血流动力学是斑马鱼AV瓣膜发育的重要机械刺激。例如，KLF2A的表达依赖于反向流动的存在，而剪切应力控制着AV管中MIR-21的差异表达。在40 hpf时，心内膜垫开始转变为原始瓣叶。心内膜垫重塑为原始瓣叶，以防止76 hpf时完全逆行。此时通过心内膜垫的血流速度约为3.0毫米/秒，*大壁面剪应力（wss）为70dynes/平方厘米。心内膜垫的形成发生在人类4.5周、小鼠e12周和鸡hh24周。在流出血管中，动脉球由一层厚的外层平滑肌细胞和一层薄的内层内皮细胞组成。这个小腔体是有弹性的，可以保证高压的保持，防止主动脉回流。与三叶哺乳动物主动脉瓣相比，流出瓣只有两个瓣叶。斑马鱼心脏的流量可以通过简单的追踪单个红细胞来测量。或者，为了进行更详细的流量分析，数字粒子图像测速（DPIV）可以通过连续帧之间的粒子位置相关性（在大多数情况下为红细胞荧光）生成空间流量图。这两种技术都需要至少每秒150帧（fps）的快速图像采集。红细胞或血浆应荧光标记以增强对比度。

　　斑马鱼的遗传途径：尽管胚胎鸡在外科/机械干扰研究中被广泛应用，斑马鱼胚胎却适合于遗传干扰。已知斑马鱼基因组序列，成功地将正向/反向遗传方法应用于斑马鱼胚胎，以确定研究特定基因功能的分子途径。正向遗传学是决定一个有机体特定表型的遗传基础。另一方面，逆向遗传学是有选择地操纵一个先前确定的基因，并分析这种操纵对生物体的影响。对于斑马鱼，通过辐射或化学处理成功地诱导了基于正向遗传学的随机突变，并为杂交后代产生了稳定的系。用这种方法产生了数百个心血管发育异常的突变体。举例来说，通过正向遗传学筛选确定了导致瓣膜缺陷和主动脉缩窄的几个突变。正向遗传学的另一个例子是双突变系casper。这种突变体没有黑色素细胞和虹膜细胞，这使得它在整个生命中都是透明的，能够进行无创成像。斑马鱼胚胎也可以利用几种反向遗传技术选择性地抑制基因功能。*常用的技术是将反义吗啉寡核苷酸（mos）注入受精卵。mos可以通过靶向转录起始位点或靶向剪接连接并诱导异常剪接来抑制翻译。有效阻止靶基因的蛋白质合成3-5天。由于在斑马鱼中易于利用，mos使基因功能的分析得以广泛应用。很快就发现一些mos工作得很好，并且有许多mos表型有效地重演突变表型，而没有任何主要副作用。然而，mos可以诱导p53依赖性细胞凋亡和基因表达中的非靶向细胞特异性效应，这可能影响表型分析。在大量的基因敲除系中，在相应的突变体中，几乎80%的Mo变形体表型没有被观察到，这导致人们质疑Mo在斑马鱼研究中的广泛应用。有人建议不应过量注射mos以限制靶向效应，必须产生稳定的突变体并对其进行适当的表征，以验证mo变形剂的表型。斑马鱼*近引进了两种反向遗传学的替代技术：TALENs和CRISPR/CAS9。这些技术影响基因组DNA而不是RNA转录。因此，它们的分子效应可以在单胚胎水平上确定，以获得明确的表型/基因型相关性。这些技术的非目标效应可以忽略不计。这些基因方法被用来在斑马鱼胚胎中产生人类心血管疾病，以揭示分子机制。有两种常见的形式：扩张型心肌病和肥厚型心肌病。对心肌病斑马鱼突变体的正向遗传筛选显示，titin、层粘连蛋白α4和整合素连接激酶的突变可导致模拟人类临床条件的心力衰竭。在一项反向遗传研究中，在鉴定了DCM患者的Eya4突变后，斑马鱼的Eya4基因通过吗啡寡聚核苷酸注射被敲除。由此产生的表型具有心肌病，表明在这种情况下Eya4突变的作用。我们的研究小组在肥厚型心肌病患者中发现了肌球蛋白结合蛋白C的几个突变，并通过吗啡寡聚核苷酸注射对斑马鱼模型中的这些突变进行了概括。心脏功能分析和血流动力学评估在这些和类似的动物缺陷模型中很重要。下面，我们将解释这些斑马鱼胚胎的分析技术。

　　明视野延时图像序列的心脏功能分析：在斑马鱼发育的早期阶段（3-4 dpf），胚胎是透明的，内部器官包括心脏和血液循环都有良好的可视性。因此，在这一阶段，视频明视野显微镜可用于心脏功能和形态的定量分析。该方法是基于记录二维（2D）图像序列以进一步进行心血管分析。动物处于侧位，整个心脏周期内心室清晰可见。在此配置中，中庭不可见。使用自动视频边缘检测系统可以测量心室功能的心肌壁。120-fps视频捕获速度足以满足此应用。收缩壁速度水平在2 dpf时约为200μm/sec，在6 dpf时约为275μm/sec。心室壁运动也可以用类似于M型超声心动图的方法进行实际分析。这里的目的是在整个心脏周期中跟踪心室壁位置的连续变化。通过首先确定感兴趣的线性区域来实现。这个区域要么是心室的短轴，要么是心室的长轴。对于M模式图像，沿这条线的强度值是Y轴，视频的每一帧在X轴中表示。这样，心室短轴和长轴直径的变化可以在整个心脏循环中测量。M型分析可以跟踪心肌壁厚和心室直径。舒张和收缩的短轴直径表示为dd和ds，心肌厚度表示为mtd和mts。图像以250 fps的速度捕获，以获得良好的时间分辨率。测量血流速度以量化斑马鱼胚胎的心血管功能。这可以通过简单地跟踪胚胎体内红细胞（RBC）的运动来实现，红细胞由于透明的皮肤很容易被识别出来。可以计算红细胞运动的加速、减速和峰值速度进行分析。红细胞在两条通过身体的主血管中的运动，在主动脉背侧和主静脉中，可以成像。

　　通过光片荧光显微镜进行三维实时成像：斑马鱼胚胎心脏的高分辨率成像要求很高，因为其心率为2-4赫兹，相对较大的尺寸约为250μm。因此，斑马鱼心血管系统的体内功能和结构成像需要*的显微镜，该显微镜可以记录高时间和空间R值的光学切片。传统的共焦激光扫描荧光显微镜（CLSM）是基于物体的点扫描。穿透深度也相对较低；因此，捕获跳动的斑马鱼胚胎心脏是很困难的，尤其是对于较老的胚胎。光片荧光显微镜（LSFM）于2004年推出，以消除CLSM的局限性。这种技术被称为选择性平面照明显微镜（SPIM）。其工作原理是利用薄激光片从侧面照射荧光标记的样品,仅在检测目标的焦平面激发荧光，同时记录发射光.LSFM中的检测系统包括CCD/SCMOS摄像机，而不是像CLSM中那样的扫描光电倍增管探测器。因此，LSFM提供了几个重要的优点，包括提高采集速度、高信噪比、低光漂白和大穿透深度。此外，在大多数应用中，样品被放置在一个专用的垂直支架（透明注射器或毛细管）中，并浸入一个充满介质的成像室中。将样品嵌入低浓度琼脂糖柱中，与传统的玻璃载玻片相比，低浓度琼脂糖柱对活的生物样品来说压力更小。垂直安装还可以在不变形的情况下旋转精密样品，并方便360°成像。因此，LSFM成为斑马鱼研究的新标准成像方式，因为它能够在生理成像介质中实现快速和高分辨率的动态成像。LSFM显著增强了斑马鱼胚胎的心功能分析。心脏内的特定区域现在可以在体内高分辨率成像。然而，为了对心脏进行完整和准确的功能分析，需要对三维重建的心脏跳动图像进行三维分析。心脏在所有维度上持续快速的运动，使得捕捉这样高分辨率的图像变得非常困难。一种解决办法是像沉默的心脏模型那样抑制心脏。然而，该模型不适用于研究心脏发育过程中的血流动力学和心脏收缩。另一种方法是使用前瞻性门控技术获得静止的3D心脏。当心脏继续跳动时，它会在成像物镜的焦平面上缓慢移动。对这些图像进行三维重建，以在这个特定阶段生成心脏模型。不能用这种方法研究心跳的动力学。心脏跳动的动力学只能通过4D成像（3d+时间）进行全面分析，这需要非常快速的图像采集和深度穿透。采集后同步技术的进步使得在在4D中捕捉斑马鱼胚胎心脏跳动的动态成为可能。?在这项技术中，心脏组织的动态运动是通过对图像叠加的回顾性时间配准来重建的。在整个心脏深度的连续光学截面上，记录下跳动的心脏的短片。然后，对连续z平面的图像序列进行回顾性登记，以制作心脏跳动的4D影片。心包细胞、心肌细胞和红细胞可以被荧光染色，以70–85 fps的速度录制的3D电影可以用于制作4D电影，实现详细和动态的心脏功能分析。*近，双光子激发与LSFM的集成导致穿透深度的增强和光板厚度的保留，从而实现了高采集速度（>70 fps）和低光损伤。为进一步提高扫描速度，已开发出新的方法。一种是多色LSFM。实现混合波长激发，实现快速多色双光子成像。通过这种方法，分别对CFP、GFP和DSRED标记的心包、心肌和红细胞进行了模拟成像。快速时间序列图像以每秒85帧的速度采集，然后用于生成心脏周期运动的4D电影。与单色LSFM相比，该技术没有产生额外的光损伤。同时对心肌和红细胞成像可改善动态分析。*后，图像采集技术的进步使4D电影能够直接录制心脏跳动。光片显微镜现在可以记录心肌壁和红细胞的动态运动；这一进展导致了*技术的应用，如粒子图像测速和计算建模，斑马鱼心血管血流动力学分析。

　　基于数字粒子图像测速（DPIV）的剪应力分析：WSS是心血管系统中作用于血管壁和瓣叶表面的摩擦力。它是剪切速率（与血管半径相关的速度导数）和血液动态粘度（流体粘度是其抗应力逐渐变形能力的一种度量）的产物。定量和定性分析心血管系统中的WSS是重要的，因为它的大小和方向都被认为有助于心脏发生。有重要证据表明，心血管内皮细胞上的WSS可显著影响血管和瓣膜的发育，以及成人有机体血管和瓣膜疾病的发病机制。具有不同流体力学特性（即稳定与不稳定、层流与湍流、顺行与振荡）的流动显示出对内皮细胞中特定基因表达途径的不同调节。因此，准确测定剪切应力模式和剪切应力水平对于心血管疾病的临床和体内研究具有重要意义。由于WSS与容器壁的轴向速度梯度成正比，因此应确定该位置的速度梯度来计算WSS。然而，由于以下几个原因，这不是一项容易的任务：复杂的几何结构、不稳定的脉冲流行为、移动的边界（即血管壁和瓣膜传单）和血液的非牛顿行为（血液粘度随剪切速率的变化、剪切减薄特性）。因此，对于WSS计算，通常采用简化假设，如理想几何、稳定流、简单抛物线速度剖面、牛顿行为等，但这些都会导致不可靠的结果。DPIV已成为体内研究确定心血管系统中速度向量和WSS水平的有力工具。对于像斑马鱼心血管流这样的小几何体，DPIV需要对流场进行微观分析。在这里，示踪粒子的直径非常重要，因此这些颗粒应足够大，能够单独识别，同时又足够小，能够跟随局部流动。对于斑马鱼血流量的DPIV，可以跟踪红细胞或注射珠。在Hove等人的开创性研究中，通过追踪红细胞来测定速度和WSS水平。

　　通过计算流体动力学（CFD）进行血流动力学分析：CFD模型在心血管研究中非常有利于研究复杂的流体行为，实验测量只能提供有限的信息。CFD模型也被用于体内研究，目的是研究发育中心脏的血流动力学。为此，胚胎雏鸡模型得到了广泛的应用。斑马鱼是另一种常用于心血管研究的动物模型。以前的研究表明，与其他动物系统相似，机械信号有助于斑马鱼心脏的发育。更具体地说，流体剪切应力和跨壁压力通过触发内皮细胞内的机械生物学机制来影响血管、腔和瓣膜的形态形成。通过发育中的心脏的血流受到干扰，导致心脏发育改变，与人类冠心病相似。然而，有趣的是，对于斑马鱼模型的详细血流动力学研究，目前还缺乏CFD研究。在一项研究中，针对一个简化的心脏几何结构（近似于4.5 dpf斑马鱼心脏）开发了一个二维CFD模型。模型是一个线性通道，两个交错的心室从通道的对侧凸出，代表心房和心室。心内膜垫存在于流入道、AV管和流出道的背侧和腹侧。?采用两种不同的方法进行血流模拟：*种方法是通过刚性几何体在入口边界定义速度入口条件。在第二种方法中，心房和心室被定义为弹性材料，收缩的心房强制血流，收缩的心房弹性地伸展心室。通过求解控制流体流动方程，得到了作用于壁面和心内膜垫上的速度流线图和WSS值。对流线型的分析表明，应考虑移动边界以准确捕捉流型。在刚性模型中，室壁*大法向应力为0.02 dynes/cm2，心内膜垫*大WSS为2 dynes/cm2。不同心内膜垫高度的模拟显示，这些垫的发育显著影响心脏内的WSS分布和大小，以及室壁压力水平。*高的WSS位于缓冲垫上，随着高度的增加，WSS也会增加。由于狭窄的房室通道具有更高的流动阻力，随着垫层高度的增加，室壁上的法向压力也显著增加。在随后的研究中，将斑马鱼血流动力学边界建模方法应用于基于真实几何的CFD模型。采用转基因斑马鱼胚胎，其中含有绿色荧光蛋白标记的内皮/心内膜细胞和GATA1标记的红细胞。GFP标记可以跟踪管腔壁的边界，而GATA1标记可以跟踪血流（通过DPIV），因此可以测量血流速度。斑马鱼胚胎在20-30 hpf到110-120 hpf阶段被纳入研究。使用荧光显微镜收集20 fps时胚胎心脏的二维图像。在每幅图像中，通过追踪荧光内皮细胞来确定管腔边界。建立了一种实用的方法来估计斑马鱼心脏中的WSS水平。该方法将活体共焦成像与CFD相结合，并基于从心壁动力学（而不是直接从红细胞运动）估算WSS水平。本研究使用48-hpf斑马鱼胚胎。在120 fps下对GATA1-DSRED标记的RBC进行实时成像，以生成4D心脏视图。在这个二维几何体上，定义了流体动力中心线，为心脏解剖提供了一维参数化。这些工作表明了计算流体动力学在斑马鱼血流动力学分析中的重要性，但为了更好地理解心脏发育的机理，还需要做更多的工作。计算机模型需要在3D中开发，并且必须结合壁动力学和流体动力学（流体-结构相互作用方法）进行精确分析。

　　结论：在过去的几十年里，斑马鱼模型已经发展成为一个非常强大的模型来研究心脏发育。正向和反向遗传干扰技术的进步使得在这些动物身上诱导人类心血管缺陷成为可能。心血管动力学已经在这些疾病模型中进行了研究，*常见的是通过基本的2D 明视野显微镜分析，该分析涉及心脏功能计算的误差。光片荧光显微镜是专门为斑马鱼胚胎研制的。这些显微镜可以实时跟踪心肌壁和红细胞的运动。因此，现在可以用这些显微镜制作4D跳动的斑马鱼心脏电影。通过LSFM快速获取图像，使得将DPIV和计算建模等*技术应用于斑马鱼研究成为可能。然而，由于斑马鱼心脏小尺寸和快速移动边界的成像和建模困难，目前大多数研究涉及二维心脏平面的血流动力学分析。开发具有不同平面同步图像采集工作原理的三维微DPIV系统将有助于斑马鱼心脏在三维中的直接和快速可视化。超声生物显微镜和光学相干断层扫描系统已成功应用于其他胚胎动物系统，以及成年斑马鱼。这些是胚胎斑马鱼成像的潜在非常有用的方式。由于体型非常小，目前的商业系统不适合斑马鱼胚胎。我们希望在不久的将来能开发出新的探针来成像胚胎斑马鱼。根据CFD建模，未来的模型应基于流体-结构相互作用方法，将壁动力学和血流动力学结合起来。整合技术来产生斑马鱼的缺陷模型，将为研究者打开新的视野。