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【动物造模】-miR-144负性调节大鼠巨噬细胞TOLL样受体2的表达

  目的:明确TOLL样受体2(TLR2)与microRNA144(miR-144)作用之间的关系。

  方法:利用不同浓度的miR-144的模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)瞬时转染大鼠巨噬细胞系NR8383细胞,RT-qPCR检测miR-144和TLR2及其下游分子TNF-α的表达。利用大鼠肝脏cDNA为模板,PCR获取目的片段(即含miR-144 野生及突变结合位点的TLR2 mRNA的3’UTR区);用SacⅠ、XbaⅠ双酶切pmirGLO报告基因载体和含miR-144野生及突变结合位点的TLR2 mRNA的3’UTR区,构建携带上述片段的双荧光素酶报告基因,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒,即pmir-TLR2-3’UTR及pmir-mutant-TLR2-3’UTR;并用miR-144 的mimics 与双荧光素酶报告基因共转染明确miR-144 与TLR2 mRNA的3’UTR 区的靶向关系。

  结果:瞬时转染100 nmol/L miR-144 mimics后,NR8383细胞中miR-144表达显著升高,而TLR2及其下游分子TNF-α表达显著下降;而100 nmol/L miR-144 inhibitor作用则相反。PCR和双酶切DNA测序结果证实pmir-TLR2-3’UTR及pmir-mutant-TLR2-3’UTR重组载体构

  建成功;用100 nmol/L miR-144 mimics与空载体及上述两个构建体分别共转染HEK 293T细胞后,pmir-TLR2-3’UTR转染组相对荧光素酶活性显著降低。

  结论:miR-144通过靶向结合TLR2 mRNA的3’UTR区负性调节TLR2及其下游促炎因子的表达。

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