动物造模,巨噬细胞 中国实验动物信息网 2023-11-17 1012

　　目的：明确TOLL样受体2（TLR2）与microRNA144（miR-144）作用之间的关系。

　　方法：利用不同浓度的miR-144的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitor）瞬时转染大鼠巨噬细胞系NR8383细胞，RT-qPCR检测miR-144和TLR2及其下游分子TNF-α的表达。利用大鼠肝脏cDNA为模板，PCR获取目的片段（即含miR-144 野生及突变结合位点的TLR2 mRNA的3’UTR区）；用SacⅠ、XbaⅠ双酶切pmirGLO报告基因载体和含miR-144野生及突变结合位点的TLR2 mRNA的3’UTR区，构建携带上述片段的双荧光素酶报告基因，并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒，即pmir-TLR2-3’UTR及pmir-mutant-TLR2-3’UTR；并用miR-144 的mimics 与双荧光素酶报告基因共转染明确miR-144 与TLR2 mRNA的3’UTR 区的靶向关系。

　　结果：瞬时转染100 nmol/L miR-144 mimics后，NR8383细胞中miR-144表达显著升高，而TLR2及其下游分子TNF-α表达显著下降；而100 nmol/L miR-144 inhibitor作用则相反。PCR和双酶切DNA测序结果证实pmir-TLR2-3’UTR及pmir-mutant-TLR2-3’UTR重组载体构

　　建成功；用100 nmol/L miR-144 mimics与空载体及上述两个构建体分别共转染HEK 293T细胞后，pmir-TLR2-3’UTR转染组相对荧光素酶活性显著降低。

　　结论：miR-144通过靶向结合TLR2 mRNA的3’UTR区负性调节TLR2及其下游促炎因子的表达。