动物造模,冠脉模型 中国实验动物信息网 2021-10-07 968

　　在小型猪冠状动脉模型研究中，药代动力学评估是评估新药物洗脱支架的重要指标。这些包括体外药代动力学研究和组织药物浓度监测。作为向所有人介绍该系统的示例，请考虑使用西罗莫司洗脱支架的小型猪冠状动脉模型实验。

　　1、试剂（1）标准西罗莫司，批号：070101、分子量：914.2 Da。

　　（2）DMORPM（内标）标准品，分子量：884.2 Da。

　　（3）酒精：Burdick＆Jackson，HPLC级，批号：G90G1H。

　　（4）乙酸：北京化学试剂公司，分析级，批号：20060512、

　　（5）乙酸乙酯：北京化学试剂公司，分析级，批号：060119。

　　（6）醋酸铵：北京伊里精细化工有限公司，分析纯，批号：20010323、

　　（7）水中的乙酸钠：北京伊利精细化工有限公司，分析纯，批号：951022、

　　（8）水：用MilliQ净化系统制备的去离子水。

　　（9）乙腈（色谱级）：美国霍尼韦尔。

　　（10）四氢呋喃（色谱级）：美国霍尼韦尔。

　　2、主要设备

　　（1）HPLC-MS/MS系统由2690高效液相色谱仪（Waters）和API-3000三重四极杆质谱仪（美国应用生物技术）组成，配备电喷雾离子源它一直。

　　（2）MilliQ纯水机（大麦仪器（上海）有限公司）。

　　（3）低温高速离心机（德国Hereus）。

　　（4）Coming320 pH计（美国康宁）。

　　（5）梅特勒AX105分析天平（瑞士梅特勒-托尔多）。

　　3、分析条件HPLC条件：选择Alltech Company Alltima C18 2.1 mm x 50 mm（3μm）色谱柱；柱温为51°C；流动相为80％甲醇和20％10 mmol/L乙酸铵（pH = 5.1）。 ）;流量0.2毫升/每个样品分析需要5分钟。串联质谱分析条件：正离子化模式下的电喷雾电离（ESI）和多反应监测（MRM）质谱扫描方法，以确定西罗莫司的母女对和内标质量电荷比分别为931.7（M +H4 +）→864.7和901.8（M +H4 +）→834.8。

　　四。体外药代动力学分析过程（1）参考物质溶液的组成：准确称量适量的西罗莫司参考物质，用乙腈水稀释（65:35），每毫升含20μg的溶液。我会。发现（2）测试溶液的制备：将6个没有聚合物载体的西罗莫司洗脱支架和6个有聚合物载体的西罗莫司洗脱支架分别浸入5ml和7％的牛血清白蛋白中。在37℃和80r/min的恒温下摇动。 2小时，1天，7天和14天后，取出支架并将其放置在离心管中。精确添加5 ml甲醇，放置4小时，超声5分钟，然后使用10μl或20μl作为测试溶液。 （3）色谱条件和系统适用性：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水（63:14:13）为流动相，检测波长为280m，流速为1 ml/min。柱温为40℃。使用参考溶液作为系统适用性测试溶液，精确测量20μl并注入液相色谱仪，洗脱顺序为西罗莫司B异构体和西罗莫司C异构体。西罗莫司B异构体的保留时间必须为15-22分钟，基于西罗莫司B异构体峰的理论塔板数必须为2000或更多，并且必须分离西罗莫司B和C异构体。学位必须为1.2或更高。

　　（4）测量：分别按照HPLC（2000年中国药典附录VD）对测试溶液和参比溶液取样并记录峰面积。根据外标方法和西罗莫司8，C异构体的峰面积总和，计算测试产品的药物含量。

　　五。冠状动脉组织中西罗莫司摄入量的体内测量

　　（1）西罗莫司储液的制备

　　1）西罗莫司标准曲线储液的制备（1 mg/ml）：公司标准产品，可准确测量西罗莫司10.13 mg转移到10毫升容量瓶中，通过加入适量的甲醇溶解，在刻度处用甲醇稀释以获得1毫克/毫升的母液（即母液），并在-30°C的冰箱中保存以备后用。去做。准确吸收0.1 ml上述储备溶液，转移至10 ml容量瓶中，用纯水稀释至刻度，以形成10μg/ ml标准曲线的标准曲线，并保存在-30°C的冰箱中以备将来使用。

　　2）西罗莫司质量控制储备溶液（1 mg/ml）的制备：准确称量10.12 mg西罗莫司标准液，转移到10 ml容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并用甲醇补足体积。稀释至获得1 mg/ml的原液，并保存在-30°C的冰箱中以备后用。准确吸收0.1 ml的上述储备溶液，转移到10 ml的容量瓶中，用甲醇稀释以得到10μg/ ml的标准溶液进行质量控制，并保存在-30°C的冰箱中以备将来使用。准确吸取1 ml上述10μg/ ml质量控制工作溶液，转移到100 ml容量瓶中，用空白动脉匀浆稀释以标记（动脉重量：水量= 1：4 g/ml），100g/ml质量控制工作溶液要得到存放在-30°C的冰箱中以备后用。 （2）内标原液的制备：准确称取5.05 mg内标原液，移入10 ml容量瓶中，加适量甲醇溶解，稀释至刻度，得到500μg/ ml原液。并储存在-30。冰箱要用。准确吸收0.2 ml上述母液，转移到10 ml容量瓶中，用甲醇稀释以获得10μg/ ml内标，并保存在-30°C的冰箱中以备将来使用。准确吸收1 ml的上述10μg/ ml内标物，转移到100 ml容量瓶中，用甲醇稀释至100g/ml内标物，并保存在4°C的冰箱中以备后用。我会。

　　（3）动脉匀浆标准曲线和质量控制样品制备：选择10头健康的小猪，建立静脉通道，牺牲流血，立即打开胸腔，摘除心脏，摘除冠状动脉组织仔细分开。精确称量组织，将其放入微组织均质器（10000r/min）中，均质化，然后将其存储在-30°C的冰箱中。

　　根据下表，使用猪空白动脉匀浆作为溶剂，低，中和高3种标准溶液，浓度分别为0.2、0.5、2、5、10、20、50和100g/ml质量控制样品准备曲线样品（低浓度0.5g/ml，中浓度20g/ml，高浓度80g/ml）。分离上述样品，并保存在-30°C的冰箱中以备将来使用。

　　精确测量8ml的空白猪动脉匀浆（动脉重量：水量= 1：4g/ml），转移到100ml容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，混合均匀，以备后用储存在-30℃的冰箱中。 ..准确测量8 ml的空白猪动脉匀浆，转移到100 ml容量瓶中，用纯水稀释至刻度，充分混合，并储存在-30°C的冰箱中以备将来使用。在室温下解冻动脉匀浆样品，混合10秒，取500μl动脉匀浆样品，加入100μl内标物（100g/ml），混合30秒。加入2 ml的0.1 mol/L乙酸钠，混合30秒。加入4毫升乙酸乙酯，混合40秒并摇动10分钟。在4℃以3850r/min离心10分钟后，将上层有机相转移至玻璃试管中，并在N2流下于40℃干燥。加入200μl化合物溶液（甲醇：10 mM乙酸铵= 2：1、v：v），混合1分钟，然后用微滤器（0.22μm）过滤。在3.6中所述的HPLC-MS/MS条件下进行测量，记录化合物的质量色谱图和峰面积，并使用内标法进行定量。

　　（4）评估的内容和方法

　　1）特异性：用于特定评估的样品包括空白猪动脉匀浆样品（双重空白），含有内标工作液的空白动脉匀浆（空白），包括质量控制。未知浓度的猪动脉样品和均质样品。在上述方法中，获得的质谱图由干扰峰的保留时间确定。评估标准：干扰峰的峰面积应小于*小定量限峰面积的20％。

　　2）标准曲线：根据上述方法处理和测量标准曲线样品。线性拟合以西罗莫司的峰面积与内标的比值为Y和浓度为X（加权因子1/x2）进行。标准曲线的曲线回归方程为Y = aX + b。评估标准：相关系数r≥0.99；*小定量浓度样品（RSD％）的准确度在20％以内；准确度（RE％）的±20％以内；其他标准曲线样品的准确度（RSD％）15％精度（RE％）必须在±15％之内。

　　3）精度和准确性：3种质量控制样品，浓度从低到高：LQC（低浓度质量控制样品），MQC（中浓度质量控制样品），HQC（高浓度质量控制样品）3.6和3.9使用中所述的方法处理五个样品，并分三批连续测定，计算日内和日内精度（RSD％）和精度（RE％）。评估标准：精度（RSD％）必须在15％以内，精度（RE％）必须在±15％以内。