大鼠固定膝关节模型 中国实验动物信息网 2021-11-23 856

　　摘要：创伤，韧带重建手术和出血性疾病（例如血友病）会导致关节出血。关节腔内出血的复发会引起滑膜炎和氧化应激，从而导致关节软骨变性和关节炎。关节固定是治疗伴有关节出血的关节骨折的常用方法。尽管关节出血对关节软骨有负面影响，但关于减少关节出血是否可以有效预防关节软骨退变尚无共识。这项研究的目的是调查关节出血联合关节固定对大鼠膝关节软骨变性的影响。

　　方法：成年雄性大鼠的膝关节用内固定器固定3天至8周。将大鼠随机分为以下各组：固定血注射（Im-B）组和固定盐水注射（Im-NS）组。在两个区域（接触和非接触区域）评估软骨。评估软骨细胞计数，改良的Mankin评分和软骨厚度。从两个区域的软骨中提取总RNA，并通过实时定量聚合酶链反应检测MMP-8，MMP-13、IL-1β和TNF-α的表达。结果：与Im-NS组相比，Im-B组两部分的软骨细胞数量均明显减少。 Im-B组在4-8周时的改良Mankin评分仅在接触区域内明显高于Im-NS组。与Im-NS组相比，Im-B组中的MMP-8和MMP-13的表达在2-4周内显着升高，而TNF-α的表达在2-8周内显着升高。 ，IL-的表达在1β时不显着。性别差异。结果表明，关节出血加剧了由固定引起的关节软骨的退化。消除关节出血或避免负荷可以防止关节固定出血期间的软骨变性。

　　背景：血管病通常是由出血性疾病引起的，例如创伤，大关节手术和血友病。关节反复出血对软骨变性有直接或间接的不利影响。出血导致铁在关节腔中积聚，导致软骨附近形成自由基，导致软骨细胞凋亡和基质变形。另外，铁诱导滑膜细胞的血管生成和过度增殖，随后滑膜的炎症引起关节炎。反复流血加剧了这种破坏性事件，单次血液暴露会引发这种破坏性事件，并导致持续的基质再生障碍和关节损伤的进展。在血液病性关节炎中，充满铁血黄素的滑膜组织会产生促炎性细胞因子，例如白介素（IL）-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α，引起分解代谢和一氧化氮，从而激活氮（NO）的表达。基质金属蛋白酶（MMP），骨关节炎和类风湿关节炎。这些细胞因子还可以增加单核细胞和滑膜成纤维细胞对铁的摄取，从而加速滑膜炎的恶性循环。然而，已证明诱导关节出血的方法，包括骨髓刺激，是通过软骨再生治疗膝关节软骨缺损的有效方法。骨折或韧带损伤后，即使经过适当的治疗或手术，也可能发生创伤后骨关节炎。根据先前的研究，创伤和手术可导致关节软骨变性，炎症，滑膜细胞肥大和创伤后骨关节炎。另外，关节固定是伤口修复的常见治疗方法，以维持休息并促进恢复，从而引起关节软骨的退行性改变，从而导致骨关节炎的发展。关节中的血液会在48小时内迅速清除，而不会固定关节。但是，一项研究报道了在关节置换术中有过多的血液残留。关节固定术可加剧血液对关节软骨的有害影响，对此尚未进行研究。因此，本研究研究了关节出血联合关节固定对大鼠关节软骨退变的影响。动物：使用12周龄的成年雄性SD大鼠。根据先前的研究确定本研究中使用的大鼠数量。共使用了108只大鼠（组织学和免疫组织学评估，n ＝ 72；基因表达分析，n ＝ 36）。通过腹膜内注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，并用塑料板和两个金属螺钉在150度屈曲的不同时间固定一个膝关节。手术后，将大鼠随机分为固定血注射组（Im-B）和固定盐水注射组（Im-NS）。 Im-B组的大鼠直接注射50μL尾静脉自体血。 Im-NS组的大鼠以相同的方式给予相同量的生理盐水。

　　组织准备：在之前的研究基础上，准备评估样本。通过腹膜内注射过量的戊巴比妥钠对大鼠实施安乐死，然后用4％多聚甲醛（PFA）0.1μM磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）固定通过主动脉。随后，切除膝关节周围的组织并将其在相同的固定剂中于4℃保持24小时。用10％的乙二胺四乙酸（EDTA）在4°C下将固定的样品脱钙2个月。用乙醇和二甲苯溶液脱水后，将样品包埋在石蜡中。为了进行评估，在膝关节的内侧le区域切开了一个5μm的矢状切面。

　　组织学评估：苏木精-伊红染色和番红素O染色（手术后1天和3天）评估股骨和胫骨接触和非接触区域的软骨变性，软骨细胞计数和软骨厚度。 2周），手术后4周和8周； =？ 6 /每组）。改良的Mankin组织学分级方案用于评估软骨变性。在给定的视野中计数软骨细胞。软骨厚度是指软骨表面与软骨关节之间的距离。使用滑膜评分系统评估滑膜炎（包括血管nu，滑膜增生和滑膜下炎症）。此外，珍珠普鲁士蓝染色（手术后2、4和8周）评估了铁血黄素的沉积。

　　免疫组织化学：将每个时期的石蜡切片脱脂并浸泡在0.3％的过氧化氢中。分化簇68（CD68）用作A型滑膜细胞的标志物。在室温下，溶于PBS的3％H2O2使内源性过氧化物酶失活20分钟。将载玻片与小鼠抗小鼠CD68抗体在4°C下孵育24小时。使用山羊抗小鼠CD68免疫球蛋白（IgG）作为二抗，并在室温下孵育30分钟。*终的检测步骤是使用带有0.1μM咪唑和0.03％H2O2的DAB作为显色剂。使用卡拉奇苏木精进行复染。阴性对照使用正常小鼠IgG作为一抗。在关节间隙和后滑膜囊中计数CD68阳性细胞。

　　基因表达分析：安乐死后，使用解剖刀和骨夹在股骨和胫骨的接触和非接触区域获取软骨。立即将收集的软骨样品浸入1 ml QIAzol中。将样品研磨并用Polytron匀浆。提取总RNA并合成互补DNA（cDNA）。 结果：组织学评价：图1显示了用苏木精和曙红染色的股软骨的组织学特征。 Im-B和Im-NS组均发生关节软骨变性。固定后，逐渐出现退行性改变，显示出接触区域的退行性改变（图1a-h）。固定和关节内给药三天后，观察到软骨细胞肿胀和切向区域的细胞丢失，尤其是在Im-B组中（图1a和B）。 1周时细胞层不规则（图1c和d）。 Im-B组的细胞染色强度更严重，并在4周内下降（图1e和f）。在Im-B组中，第2周观察到软骨表面不规则。细胞克隆和细胞丢失发生在第8周（图1g和h）。图1（i-p）显示了非接触区域的恶化。在接触区和非接触区观察到相似的细胞结构，但是非接触区的软骨变性小于接触区的软骨变性。两组均在8周时观察到藏红素O的染色强度降低。 Im-B组比Im-NS组更严重。 Im-B组的Mankin评分在4周时显着高于Im-NS组，而胫骨在4周和8周时显着高于Im-NS组。非接触区没有显着变化，Im-B组和Im-NS组之间也没有显着差异。与Im-NS组相比，Im-B组的股骨接触区的软骨细胞数量在第3周和第8周时显着减少，而在胫骨接触区的软骨细胞在3周时显着减少。 ，第1周和第8周。在Im-B组的非接触区域中，股骨和胫骨中软骨细胞的数量在3天和1周内显着减少。软骨厚度没有变化，接触和非接触区域的固定和关节内给药均不影响软骨厚度。在所有阶段，Im-B组滑膜炎评分均略高于Im-NS组，但无显着差异。

　　珍珠普鲁士蓝染色评估铁的沉积。血液注射会导致关节出血，但是Im-NS组没有铁矿石沉积物。 Im-B组滑膜和弯液面表面有铁沉积，持续至给药后8周。在Im-B和Im-NS组中，我们都能看到CD68阳性细胞主要分布在滑膜中。 Im-B和Im-NS组中CD68阳性细胞的数目在4周和8周之间略有增加，但没有显着差异。与 -Im-NS组相比，Im-B组的股骨在第2周时MMP-8和MMP-13的表达显着增加，在第2周时在胫骨中MMP-8的表达显着增加。与Im-NS组相比，Im-B组的股骨和胫骨中MMP-8和MMP-13的表达在2周内显着增加。 IL-1β表达无明显差异。 2周后，与Im-NS组相比，Im-B组的股骨接触区TNF-α表达明显增加。与Im-NS组相比，Im-B组的表达在第8周时在股骨的非接触区和第4周和第8周时在胫骨的非接触区显着增加。

　　结论：关节出血加剧了由关节固定引起的软骨变性。消除关节出血或避免负荷可以防止关节固定出血期间的软骨变性。