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【动物造模】-细菌性和真菌性角膜炎:体外兔和人角膜模型

  方法:将分离的兔和人角膜及巩膜环置于器官培养基中,并用108株金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,白色念珠菌和茄形镰刀菌感染角膜。这种感染用手术刀刺伤。将传染性细菌的悬浮液注入暴露的角膜或基质中。接种后,将角膜在37℃下保持24和48小时。孵育后,将角膜匀浆以确定集落形成(CFU)或将正常染色用于组织学检查。比较单一和混合感染。

  结果:24小时后,与金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌相比,CFU显着增加。但是,在感染白色念珠菌或茄镰刀菌的角膜中未观察到这种增加。在大多数感染的角膜组织中,注射诱导的感染导致大约2到100倍的增加。女性的组织学损伤和注射模型显示,铜绿假单胞菌在整个角膜中广泛浸润,而金黄色葡萄球菌,白色念珠菌和茄形镰刀菌浸润较少。该模型还支持超级感染。结论:女性和注射方法均适用于体外兔和人角膜感染。这些简单且可重现的模型为检测和治疗微生物性角膜炎提供了有用的替代模型,尤其是在体外和体内,这可能是由两种感染性微生物引起的。

  简介:微生物角膜炎是世界范围内的主要问题,并且是视力丧失和失明的重要原因。体外细胞培养和体外模型已用于研究疾病的各个方面,包括致病性和治疗策略。体内研究需要使用多种动物模型。这些动物的福利已成为重要的伦理问题。解决这些问题的一种方法是使用含有永生或原代角膜上皮细胞的体外细胞单层培养物。但是,这并不代表身体状况。不同的上皮细胞,环干细胞和角膜基质细胞缺乏互连的三维(3D)结构。

  *近,人们正在使用角膜模型研究角膜炎。但是,这些模型没有免疫成分。这些模型已用于研究伤口愈合,微生物附着和分子微生物致病性。在我们的实验室中,我们正在研究使用体外角膜模型的角膜上皮再生和炎症模型。通过在角膜上轻轻摇动培养基,可以将它们维持培养至少4周。据我们所知,体外角膜模型不能比较细菌,真菌和混合感染。据报道,对兔子和人类角膜的单一和混合感染进行了比较,以更好地了解这些模型在微生物性角膜炎中的应用。

  材料和方法:材料:我们使用了两种类型的兔子:野生棕色兔子和新西兰兔子。两只兔子的角膜性能没有差异。人角膜来自角膜库。兔角膜分离:用聚维酮碘消毒后,将角膜瓣环与角膜瓣环分开,立即放入磷酸盐缓冲液中。

  分离的角膜器官培养:器官培养如上。将人和兔角膜放在35毫米培养皿中,并使上皮侧更靠近培养皿底部。将500μLDMEM中琼脂糖(0.5%w/v)溶液转移到角膜的内皮侧。溶液固化后,将培养皿翻转过来,使上皮面朝上。中度DMEM:Ham's F12含10%胎牛血清,100U/ML青霉素100U/ML链霉素,2.5μg/ L两性霉素B,5μg/ L胰岛素和10g/mL表皮生长因子(EGF)补充剂。在水下的角膜中。感染前,用PBS清洗角膜3次,并在无抗生素和无真菌的培养基中孵育至少24小时,以去除残留的抗生素。所有实验工作都是在英国的兔子角膜和印度的人类角膜上进行的。

  细菌和真菌培养:金黄色葡萄球菌(s-235),铜绿假单胞菌(som-1),白色念珠菌(SC5314),用于兔角膜的茄镰刀菌(NCPF2699)。用于人角膜的菌株是金黄色葡萄球菌(25923),铜绿假单胞菌(27853)和白色念珠菌(90028)。将所有细菌和真菌菌株在Brainheart Infusion Agar(BHI)上于37°C过夜培养,然后在4°C下保存。由于需要进行实验,将琼脂中的单个克隆置于肉汤培养基中,并在37°C下孵育过夜。固定相微生物用于兔角膜实验。对于人类角膜实验,请在接种角膜的当天接种新鲜的肉汤,并根据规定的生长曲线进行接种。

  体外角膜感染:手术刀损坏角膜(3个垂直对角线和3个水平对角线)。在角膜上放置一个金属环,以创建一个防水和气密的空间。用108个金黄色葡萄球菌,白色念珠菌,铜绿假单胞菌或茄枯萎菌接种金属环的中央区域。或者,注入相同数量的细菌。将感染的角膜在37°C下培养24或48小时,将得到的悬浮液匀浆并稀释,然后在琼脂板上计数菌落。还处理了感染的角膜,切片(细菌)用克染色,(真菌)用高碘酸希夫(PAS)染色。未暴露于微生物的角膜用作对照。角膜表面微生物成像:金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌用4°C,1 mg/ml异硫氰酸荧光素(FITC)标记,并用PBS洗涤4次。对于真菌,将整个角膜用1:1荧光增白剂和10%氢氧化钾(v/v)覆盖10分钟,然后用PBS洗涤3次。用荧光显微镜对感染细菌和真菌的角膜成像。 结果:兔和人角膜的肉眼观察:与未感染的角膜相比,细菌和真菌感染的浊度显着增加。在所有角膜上都有伤口,但是受感染的角膜比未感染的角膜更明显。在感染的兔子和人角膜中发现了FITC标记的细菌。发现金黄色葡萄球菌在24和48小时内覆盖了角膜表面。在某些部分检测到直径为5至25μm的细菌簇。另一方面,与在金黄色葡萄球菌中观察到的角膜相比,在24小时和48小时后被铜绿假单胞菌感染的角膜具有较少的聚集。用荧光增白剂染色的白色念珠菌感染的角膜表面显示出更均匀的散布,24小时后在角膜表面出现少量的菌丝。但是,48小时后,白色念珠菌和菌丝的分布增加。在兔和人角膜的不同位置,茄枯萎菌在24小时内显示出更多的菌丝分布。 48小时后,角膜表面覆盖有一层真菌,并且观察到菌丝从真菌体移开,在所有方向上刮擦并延伸。兔子和人角膜表面的细菌和真菌覆盖率相似。

  兔和人角膜单种感染:注射方法涉及将细菌和真菌引入基质。单种生物注射与手术刀法相比在24小时后产生更高的CFU /角膜(P\u003c0.05),除了白色念珠菌外,其他差异均不显着。可以看出,铜绿假单胞菌覆盖上皮并穿透整个后弹性膜。这与疫苗接种方法无关。白色念珠菌在人和兔角膜中的分布相似。酵母细胞和菌丝元素靠近划痕区域,并且未穿透150μm以上的基质。 48小时后进入间质的菌丝数和白色念珠菌细胞数与24小时后观察到的无明显差异。茄镰刀菌在24小时内的组织渗透率低于白色念珠菌,并且接种部位的基质渗透率不超过10μm。但是,入侵深度和数量在48小时后都增加了。

  角膜上的两种细菌感染:两种细菌模型可以覆盖受感染兔子和人角膜的细菌种类。与单次感染相比,铜绿假单胞菌细胞浸润含有后弹性膜的基质,而金黄色葡萄球菌似乎扩散到注射部位之外。白色念珠菌和铜绿假单胞菌的混合感染是*常见的临床感染。在这种混合感染的体外模型中,两个角膜在女性受伤后24小时内被细菌覆盖,铜绿假单胞菌在菌落数和组织学上均显示出优势。

  结论:我们已经实现了在人类和动物中建立再生性角膜感染的目标。毫无疑问,模型(包括动物)不是自然人类传播的理想替代品。尽管如此,获得的数据仍然有用。可以建立可重现的体外和真菌感染模型,表明回收的细菌/真菌的*终数量与自然的体内实验相当。

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