疾病动物模型,基因敲除小鼠模型 中国实验动物信息网 2021-03-08 2839

　　大鼠和小鼠在生命科学实验室中可以说是明星，成功的大鼠和小鼠鼠模型可以说是“生命科学的出色助手”，许多人可能想要设计或了解条件基因敲除小鼠。

　　条件基因敲除小鼠设计使用Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性重组酶系统。这里我们以Cre/LoxP系统为例。例如，将loxP序列放置在要敲除的目标DNA序列的两端，以获得flox（flankedbyloxP）小鼠。 Flox小鼠与表达Cre的小鼠交配，以获得在特定细胞中敲除靶基因的小鼠，即条件性敲除小鼠。此外，与控制Cre表达的其他诱导系统（例如CreERT2）结合使用时，可以在时间和空间上同时控制基因。

　　Cre/loxP系统源自噬菌体，可介导位点特异性DNA重组。该系统包含两个组件。一个是一个34 bp长的DNA序列（LoxP序列），其中包含两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中心的这八个碱基决定。该LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。一种组分是Cre重组酶。一种由噬菌体编码的343个氨基酸组成的蛋白质。 Cre介导两个LoxP位点的重组，这可能导致两个LoxP之间的DNA序列缺失。通过在组织或细胞特异性启动子下对Cre重组酶cDNA进行基因改造，可以获得特异性表达Cre组织/细胞的Cre小鼠（也称为Cre工具小鼠）。与Flox小鼠交配后，您可以得到条件性剔除小鼠。所谓的Flox小鼠是位于特定基因的特定外显子两侧的LoxP序列。 LoxP（也称为Flox小鼠）对该序列进行了Franked处理。通常通过设计和构建靶向载体，胚胎干细胞重组，胚泡显微注射和嵌合小鼠传代来获得这种Flox小鼠。这种小鼠与Cre工具小鼠交配，并且Cre表达介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP位点序列之间的序列。不同的Cre工具由于小鼠Cre表达的组织/细胞特异性，可以实现在不同组织和细胞中特异性敲除靶基因的目标。上皮细胞，胸腺细胞，T细胞，B细胞，心肌细胞，肠，肺等

　　如何设计条件敲除鼠标此处提到的设计主要是Flox鼠标设计。所谓的条件敲除意味着除一个细胞外，其他细胞中均没有异常的基因表达。通常情况下，请勿将LoxP序列置于*个外显子之前。*个外显子通常是启动子。放置LoxP序列可破坏或改变启动子活性。有条件的敲除通常是首先引起移码突变的外显子的敲除。在这种情况下，*好不要在起始密码子ATG处敲除外显子。否则，该基因可能使用ORF的ATG来编码一种蛋白质，该蛋白质缺少部分N端序列，而该部分可能具有野生蛋白的全部或部分功能。如果您选择一个外显子进行敲除（外显子的每一侧都有一个LoxP），则外显子的基数不能为3N。否则，新基因pre-RNA剪接的mRNA将无法产生移码突变。与野生蛋白相比，它产生的新蛋白缺少中间序列。如果外显子的碱基数为3N +1或3N + 2、则在敲除外显子后会发生移码突变，从而可以实现基因敲除的目的。当筛选待凝结的外显子时，通常选择*上游的外显子作为合适的外显子。请记住，常见的DNA分析软件无法确定内含子和外显子之间的边界，应仔细检查。超过95％的边界遵循gt/ag边界的原则。您还可以在Ensembl上看到该基因的外显子和内含子。该网站上的大多数结果都是正确的。但是，还需要仔细检查。毕竟，开发基因敲除小鼠是一个相对较长的过程，需要特别注意。早期没有太多要考虑的事情。这些原则只是一般主题的考虑因素。在特殊情况下需要特殊处理。例如，如果您想敲除一个基因的特定结构域，或者该基因的外显子非常大，那么即使该外显子具有3N个碱基，您也可以在此时进行敲除。