动物造模 中国实验动物信息网 2022-01-31 3452

　　简介：脉络膜新血管形成（CNV）和视网膜新血管形成（RNV）的动物模型的发展有助于在这种情况下对生物学的理解。还开发了这些模型来测试新的治疗方法。该模型总结了许多人类CNV和RNV的临床表现，但是模型开发的时机，疾病进程，病变大小和外观均不相同。我们将具体介绍各种CNV和RNV动物模型的优缺点。这篇评论是全面的，而不是百科全书。脉络膜动物模型：脉络膜新血管形成（CNV）是对特定刺激的非特异性反应。在许多脉络膜视网膜疾病中，CNV是一个动态过程，涉及起始，维持和变性阶段。退化期的特征在于减少与瘢痕形成和纤维化相关的细胞因子的产生。 CNV可能显示为新的，或者在非活动CNV区域中被重新激活。年龄相关性黄斑变性的CNV患者每月增加约0.2片（DA）。 CNV的发作始于玻璃膜破裂或有缺陷。这可能是继发性创伤破裂，退化过程，组织牵拉和/或炎症。发生这种情况时，脉络膜毛细血管内皮细胞，周细胞，成纤维细胞和炎性细胞进入视网膜色素上皮（RPE）和/或视网膜下间隙。 CNV具有炎症，血管生成和细胞外基质成分。血管内皮生长因子（VEGF）和血小板衍生的生长因子（PDGF）由周围细胞外基质和内皮细胞的生长和被膜（ECM）介导，似乎对CNV的形成至关重要。 CNV的形成可分为三类：炎症，血管生成和蛋白水解。这些系统是相互关联的。 CNV涉及几种炎症系统，包括补体系统，细胞因子和趋化因子。血管生成促进因子刺激CNV血管内皮细胞的增殖，包括血管内皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）。蛋白水解成分包括暂时的纤维蛋白基质射线，这是CNV的物理位置。纤维蛋白充当CNV生长的支架。纤维蛋白源自循环纤维蛋白原的转化。组织因子（TF）受体是丝氨酸的共激活因子，丝氨酸是一种促进凝血酶和血纤蛋白的蛋白酶。 TF也与炎症，细胞粘附和血管内皮生长因子分泌有关。凝血酶敏感蛋白具有抗血管生成特性，但也促进血管生成促进分子的释放。对于CNV发病机理重要的细胞包括巨噬细胞和RPE巨噬细胞，它们被认为在此过程中起重要作用，因为它们表达血管生成细胞因子（VEGF）和肿瘤坏死因子。PE表达VEGF，MCP-1和IL-8，因此是该过程的重要调节剂，所有这些都调节单核细胞和内皮细胞募集。 CNV的动态阶段（启动，维护和退化）取决于在此过程中单元信号是打开还是关闭。这些矛盾的信号包括促炎和抗炎，血管生成和蛋白水解。氧化损伤和炎症刺激与年龄有关的黄斑变性，而CNV血管生成具有与免疫有关的机制。年龄相关性黄斑变性中*广泛研究的炎症级联反应是补体途径，其中竞争性蛋白增强或阻断这些途径。 VEGF是CNV血管生成的主要引发剂。血管生成因子包括血管生成素1和2、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），血小板衍生生长因子（PDGF）和KDR/Flt-1、内源性血管生成抑制剂包括PEDF，血管抑素和内皮抑素。视网膜色素上皮因子（PEDF）是一种天然的抗血管生成蛋白。通过调节巨噬细胞的活性，PEDF还具有抗炎作用。 激光和光导CNV模型：大鼠和小鼠：Dobi在灵长类动物中构建了*个CNV模型后，于1989年创建了大鼠CNV模型。通过扩大的瞳孔和角膜盖玻片，作者创建了一个氩激光光凝点（647m，100μM50-100 MW，0.1秒）。通过破裂玻璃膜，形成中央气泡或在没有视网膜内或脉络膜出血的地方形成点。创建24％CNV荧光血管造影的证据。用光学显微镜和电子显微镜检查摘除的眼睛，显示出60％的CNV病变的病理学证据。弗兰克（Frank）及其同事在1989年还开发了一种老鼠模型。该模型使用a激光（绿松石或绿色波长，500μM50 MW，0.02 s）破坏玻璃膜和CNV。指导C57BL6小鼠使用k激光并更改设置以减小光斑大小，增加强度，缩短持续时间（绿松石或绿色波长，50um50-350μ400mW0.05s），CNV增加发生率（100％）。使用大鼠激光诱导的CNV模型研究金属蛋白酶3组织抑制剂和组织因子在CNV形成中的作用。它也用于药物干预实验。在小鼠模型中，血管内皮生长因子已被证明是CNV的主要刺激因子。该模型，特别是转基因小鼠的免疫组织化学染色，已用于研究CNV的各种成分，包括碱性成纤维细胞生长因子2（FGF2）和基质金属蛋白酶。阿尔伯特和他的同事们使用循环光来指导CNV大鼠模型。在此模型中，大鼠暴露于3000 lux的光照周期中1、3或6个月。结果显示，显微镜下的RPE血管生成在1个月时出现，视网膜血管生成在3个月时扩散到视网膜外，并且在6个月时出现了与视网膜血管相关的多个局部组织。光照下动物视网膜的免疫组织化学染色是HNE，它可以测量omega-6多不饱和脂肪酸的过氧化反应并表明氧化应激。灵长类动物，兔子，猪：Ryan等人已经开发了*个CNV动物模型，即实验性CNV灵长类动物模型“视网膜下血管生成”。*初的工作室通过巩膜和玻璃体将胶原酶注入视网膜下腔。这会对玻璃膜造成机械或酶损伤。这些微创技术降低了CNV的发生率，并增加了激光损坏玻璃膜的发生率。瑞安（Ryan）使用氩激光（488m和514m，50200μm，200-950 mw，0.1-0.5s）破裂玻璃膜并在食蟹猴中诱导CNV。大约40％的猴子CNV具有血管造影的证据。大约90％的证据表明超细结构发生了变化。这些研究提供了早期缺血效应的实验证据（随后的研究表明，血管内皮生长因子处于缺血状态）。炎症涉及巨噬细胞和RPE在CNV形成中的作用。 CNV的几种灵长类动物模型在光动力疗法的发展中起着重要作用。 Criswell和他的同事使用“新世界”猴子创建了CNV模型，并将其与“旧世界”食蟹猴创建的CNV模型进行了比较。优化的激光参数显示新大陆猴子中有65％的激光光斑，旧大陆猴子中有37％的激光光斑。这些CNV病变扩展到原始的光凝点之外，并包含弥漫性视网膜下纤维组织。灵长类动物模型的益处包括猴子视网膜和黄斑，并且在灵长类动物眼中对药物递送的研究与人类相似。缺点包括动物使用和繁殖的成本，以及在小鼠和大鼠是可靠模型时使用灵长类动物的伦理问题。已经开发出了啮齿动物和灵长类动物之间的模型，即激光诱导的CNV兔模型。该模型避免了灵长类动物模型的成本和道德问题。兔子没有黄斑。与具有血管的灵长类和啮齿类动物不同，兔视网膜是由骨髓射线提供的。该模型使用视网膜下激光光凝术创建CNV。另一个中间激光CNV模型是猪。 Saitama等人使用激光二极管（75μm，400 MW，0.1 s）创建了玻璃膜缺陷的猪模型，并建立了100％CNV病变的组织学证据。组织学分析部分用于评估药物对CNV的治疗。

　　手术诱导的CNV模型：大鼠和小鼠：视网膜或脉络膜新血管形成的大鼠和小鼠模型主要通过向合成肽，血管内皮生长因子，细胞和病毒中注入非活性合成载体而具有免疫力。 Spilbury等人在视网膜下注射表达大鼠VEGF164的重组腺病毒载体是由CMV启动子驱动的。尽管发现荧光素血管造影和病理学证据高达80％，但不能排除穿刺玻璃膜有助于诱导CNV的可能性。 Baffi等人将5-10μl的表达VEGF165的腺病毒载体注射到大鼠的视网膜下间隙中。荧光素血管造影，组织学和电子显微镜检查显示大多数眼睛有CNV。作者使用FITC标记的葡聚糖来扩张视网膜。现在这是标准程序。 Wang等人使用表达人类血管内皮生长因子（或GFP）的2μL腺病毒载体和在大鼠视网膜下注射的CMV启动子进行了类似的研究。PE血管内皮生长因子表达，血管造影和CNV的组织学证据的广泛研究表明，大约90％的大鼠患有CNV。与对照组相比，CNV大鼠的视网膜电图（ERG）和b波降低了约50％。视网膜下注射本身引起的玻璃膜外伤可能足以引起CNV。兔：早期研究表明，视网膜下注射可引起视网膜色素上皮细胞增殖，在显微镜下在兔眼中可观察到CNV。 Tamai等人发现，向视网膜下腔注射视网膜下注射12.5-25 ul（LHP）会在兔眼中诱导CNV。血管造影显示46％的兔子患有CNV，并且TNFα，PDGF，VEGF，TGFβ，bFGF和IL1α上调。i和他的同事通过玻璃体向视网膜下腔注射了50 uL内毒素，生长因子，肝素珠，FGF-2和100gLPS的50μg肝素琼脂糖。荧光素血管造影，眼相干断层扫描（CT）和组织学检查结果显示100％的眼中CNV增长。原发性脉络膜新血管形成生长到视网膜下间隙，并损害玻璃膜。它在注射部位可见2周，注射后稳定3个月。注射后8个月，继发性CNV从注射部位延伸到两只眼睛的视网膜下间隙，而CNV长达3年。 CNV的特征阶段是启动，增长和维护。与人CNV相似，它可以抑制皮下地塞米松。 Qui和他的同事们通过玻璃体将10μl的Matrigel和750μg的VEGF注入了兔眼的视网膜下腔。除了荧光素血管造影和组织学检查外，他们还使用OCT来显示100％的眼睛在接种疫苗后1-9周内患有CNV。免疫组织化学和电子显微镜。 ICG成像和电子显微镜检查显示了模型中脉络膜的变化。

　　公猪：机械诱导的猪CNV模型主要出现在发达国家丹麦。 Sourbane及其同事先前的研究表明，由脉络膜上腔注射碱性成纤维细胞生长因子而不是CNV引起的脉络膜内血液生成不会损害玻璃膜。 Kiilgaard等人发现，氙气激光凝结会出现猪CNV。PE激光二极管激光光凝和心脏复律分别对玻璃膜造成54％，83％和100％的损伤。已经证实，CNV的发展需要破坏玻璃膜。机械模型是在向视网膜注射盐水以诱导伤口切除和玻璃体视网膜下的视网膜脱离之后的视网膜刮除器。通过眼底检查，荧光素血管造影术和组织学检查，进一步检查了机械诱导的模型以指示纤维血管组织（CNV）的位置。免疫组织化学表明，猪CNV的细胞因子产生和组成与人CNV相似。此外，像兔子的眼睛一样，猪的眼睛也足够大，可以进行药物递送实验。缺点类似于机械诱导的CNV动物模型。

　　非人类灵长类动物：Ryan通过向视网膜下间隙注射胶原酶和透明质酸酶建立了早期灵长类动物模型。 Cui通过视网膜切口将80ul VEGF明胶微球注射到恒河猴的视网膜下间隙。对眼底和血管造影的观察表明，92％的猴眼患有CNV。

　　转基因和基因敲除小鼠脉络膜血管生成模型：

　　VEGF164RPE65与年龄相关的巨噬细胞转基因小鼠，该模型中很少有动物在CNV中自发发育

　　CCR2/CCL2缺陷型小鼠模型：CCL2在CCR2缺陷型小鼠模型，RPE和脉络膜中无法在该区域募集巨噬细胞。这允许C5a和IgG的积累并诱导血管内皮生长因子的产生。 ApoE过表达模型：高胆固醇血症小鼠的RPE区域和玻璃膜上有类AMD的变化。 Malek等人证明，高脂高胆固醇饮食喂养的ApoE4过表达转基因小鼠在65至127周之间会产生CNV。

　　Cp/Heph-/Y基因敲除小鼠：铜蓝蛋白和铁转运辅助蛋白的缺失导致转基因小鼠出现AMD样变化。这些小鼠发生RPE和感光细胞变性。 BST 16号染色体自发突变小鼠：这些小鼠自发性发展视网膜病变。

　　总结：没有理想的CNV动物模型。血管内皮生长因子的过表达不足以支持CNV的发展。需要玻璃膜，机械或生物诱导方法来产生CNV。所有模型均需要玻璃膜介导，血管内皮生长因子和炎性细胞因子表达。视网膜新血管形成的动物模型：视网膜新血管形成的病因比CNV更好。大量的临床和实验观察表明，缺血是视网膜新血管形成的主要原因。视网膜血管变弱引起的视网膜缺血与所有疾病有关，包括糖尿病性视网膜病变，早产儿视网膜病变（ROP），视网膜中央静脉阻塞和视网膜分支静脉阻塞（称为缺血性视网膜病变），这是一个共同特征。视网膜新生血管疾病是由早产儿视网膜病变引起的。氧气诱导的视网膜新生血管模型：氧气诱导的视网膜病变动物模型（OIR）已成为缺血性病理性新生血管形成的主要模型。这种模式首先出现在猫中，然后扩展到其他动物物种，例如大鼠，小鼠，狗和斑马鱼。一个共同的特征是在视网膜发育的早期阶段高氧暴露会导致正常视网膜血管发育的停滞或延迟。这种缺血介导的病理性血管生成使得OIR模型可用于研究其他缺血性视网膜疾病，例如糖尿病性视网膜病。结论：视网膜新血管形成的两种主要类型是CNV和RNV。 CNV来自脉络膜的毛细血管循环，穿过玻璃膜并在视网膜下腔内生长。NV是由视网膜扩展到玻璃体后界面或玻璃体而产生的。通常限制CNV，限制细胞增殖，RPE控制病变的大小和程度。NV随便生长，弥漫性血管生成细胞因子进入玻璃体。