动物造模,人胃癌裸鼠转移模型 中国实验动物信息网 2021-10-09 1762

　　背景：胃癌是世界上第四大*常见的恶性肿瘤，是仅次于肺癌的第二大死因。当前的诊断和治疗已大大延长了早期胃癌患者的预后，但诊断后每个阶段胃癌患者的5年生存率均低于50％。转移是胃癌高死亡率的部分原因。约50％的胃癌患者死于腹膜转移。因此，转移已成为许多胃癌研究的热点。转移是一个非常复杂的过程，涉及多个连续步骤。涉及细胞粘附，运动，增殖，存活，代谢和信号转导的基因在肿瘤转移中起重要作用。这些蛋白质如何协同作用促进转移尚未得到很好的了解。先前报道的转移性人胃癌的小鼠模型提出了多种挑战。裸鼠原位移植需要手术，并且移植的肿瘤组织来源于人胃癌细胞系，而不是患者。结果，外科手术过程很长，并且可能导致小鼠大量出血和死亡。原位肿瘤形成率接近80-100％，但转移率不高，肝肿瘤转移率为45-60％，腹膜转移率仅为40％。因此，这些小鼠模型的建立可以受益于促进移植并导致更强转移的改良方法。此报告描述了转移性人胃癌的小鼠模型，该模型解决了以前的小鼠模型的问题。通过皮下移植直接来自胃癌患者的肿瘤组织，建立了转移性胃癌的小鼠模型。与先前描述的其他小鼠模型相比，该小鼠模型形成更高比例的肿瘤，更重要的是，表现出强大的转移能力。

　　方法：4-6周龄的BALB/C裸鼠，雄性和雌性重16-18g，新鲜肿瘤组织被切除并立即移植。裸鼠皮下新鲜肿瘤组织皮下移植的实验研究：将胃癌患者切除的新鲜肿瘤组织切成1立方毫米，用DMEM稀释剂稀释，然后在裸鼠的左右腋窝和and部皮下进行皮下移植。它。无菌16G针头。每个样品以每只小鼠5-6片（0.8毫升）的剂量移植到4只小鼠中。当裸鼠肿瘤长到1立方厘米时，通过颈脱位法杀死了小鼠，在无菌条件下检查并切除了肿瘤组织。每只小鼠的肿瘤组织分为三部分，一部分用于移植到裸鼠的另一轮肿瘤，另一部分用于免疫学，用于CK8/18的病理学检查和检测。用10％甲醛固定用于组织化学（IHC） ）染色。实时PCR分析E-钙粘蛋白，VCAM-1和ICAM-1、第三部分储存在80℃的液氮和CK8/18中，E-钙粘蛋白，VCAM-1和ICAM-1、解剖并检查小鼠腹膜，腹腔，肝，脾，胃，肠，肾，肺和脑中的肿瘤转移。收集的组织用10％甲醛固定以进行病理检查。建立和鉴定转移性胃癌的小鼠模型：在无菌条件下，将5-6（0.8mL）切除的肿瘤组织在无菌条件下皮下移植到5只裸鼠的左右left中。如上所述，切除和稀释肿瘤组织，检查和切除裸鼠中的肿瘤生长，以及检查和治疗移植的肿瘤组织和转移性肿瘤组织。对移植部位转移率的影响：如上所述，从裸鼠移植的人胃癌组织在无菌条件下皮下移植到三组裸鼠在不同部位。平均每只小鼠移植5-6只小鼠，一组在左右腹股沟接受组织，另一组在左右腋窝接受组织，第三组在背部接受组织，分为两组。部分。如上所述，在裸鼠上进行了肿瘤生长测试和切除。进一步的分析包括检测各个部位的肿瘤生长，腹膜和腹部转移。冷冻保存和传代裸鼠移植以及在人胃癌组织中的移植：将人胃癌组织裸鼠移植到第4代和第8代裸鼠中，储存在液氮中，并如上所述进行皮下移植。进一步的分析包括肿瘤生长以及在各个部位的腹膜和腹部转移。病理观察裸鼠移植和胃癌转移的组织：10％甲醛，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色（HE），观察人胃癌裸鼠移植和转移的固定性。免疫组织化学染色：采用免疫组织化学方法检测裸鼠移植和转移性肿瘤组织中E-钙粘蛋白，VCAM-1、ICAM-1和CK8/18的表达水平。染色切片取自手术标本，移植的转移性肿瘤组织和含有转移性肿瘤的组织。用于染色的试剂包括SP-9000组氨酸加试剂盒，3-3'-二氨基联苯胺四氯化物（DAB）试剂盒，抗E-钙粘蛋白一级小鼠单克隆抗体（1：200稀释度），ICAM-1（1：200稀释度）。 500稀释）包括在内。和兔抗VCAM-1一抗多克隆抗体（1：500稀释度）。两名病理学家分别对IHC染色的切片进行了评估，并确定结果差异可以通过共识解决。染色强度被评定为阴性，弱，中等或强。 总RNA提取和实时PCR：Trizol用于从裸鼠和用于移植的手术标本中生长的已移植和转移性肿瘤组织中提取总RNA。 CDNA通过逆转录酶合成。 SyBR预混探针用于实时PCR。 20μL反应溶液包含10μLSyBr预混物EXTaqTM，1μLDNA模板，0.4μL每种引物和8.2μl无菌水。 PCR循环条件为37℃×5分钟，95℃×30秒，95℃×5秒，40个循环，60℃×30秒。将β-肌动蛋白mRNA用作内部对照，将没有模板DNA的反应混合物用作阴性对照。所有样品均进行了3次单独测试，并通过对比CT对定量PCR数据进行了分析。

　　结论：肿瘤的形成和转移：在第76天的*个手术标本中，四只小鼠中只有一只在移植部位发生了肿瘤。 25天后，小鼠出现颈脱位并分析了肿瘤。肿瘤组织的平均大小为1立方厘米，显示出完美的包膜和坚硬的质感。肉眼检查发现腹膜后转移。腹膜，腹腔，肝，脾，胃，肠，肾，肺和脑均无转移。病理分析表明，移植的肿瘤和转移性肿瘤组织由分化较差的癌细胞组成，仅具有少量的间充质和血管。在一项涉及将肿瘤组织移植到四只小鼠中的平行研究中获得了相似的结果。移植后第二十六天，只有一只小鼠患上了肿瘤。在腹膜，腹腔，肝，脾，胃，肠，肾，肺或脑中未发现转移。移植有第二和第四手术标本的其他小鼠均未显示肿瘤生长。 多代后的移植肿瘤稳定性：*个手术标本被遗传了10代。不管原始组织是新鲜的还是冷冻的，肿瘤的生长都是100％，腹膜后和内脏转移是80-100％（平均94％）。在食管的淋巴结，胃黏膜下层，浆膜，脾脏，肺门区域，中心静脉和正弦波，肝实质，肝囊，肾门，肾实质，肾上腺，肠浆膜，胰腺和血管中发现转移灶。

　　不同部位的肿瘤转移率：移植在不同部位上对肿瘤转移率的影响，而不是对肿瘤生长率的影响。腹股沟植入物引起腹膜后和内脏转移的94％，背部植入物引起腹膜后和内脏转移的10％。腋窝移植后，没有腹膜后转移，有20％的器官转移。发生时间：腹股沟肿瘤移植16天，背部肿瘤移植20天，腋窝肿瘤移植14天。转移器官包括肝（50％），肾（44％），肠（28％），食道（12％），胰腺（12％），胃（6％），脾（6％）和血管。包括6％）。 ））。

　　移植和转移性肿瘤的特征：IHC和实时PCR结果表明，ICAM-1、VCAM-1和CK8/18主要在原发性和*代可移植性肿瘤以及E-钙黏着蛋白中表达。不会发生。原发性和*代肿瘤的VCAM-1和CK8/18呈阳性染色，但后代对这些蛋白的染色较弱：VCAM-1染色为第二。*代（++）呈中等阳性/ 18，信号较弱（ +），CK8被染色为*代弱信号（+）。各个时期肿瘤的E-钙粘蛋白染色均为阴性，而每一代转移性肿瘤的E-钙粘蛋白，ICAM-1、VCAM-1和CK8/18染色均为阴性。

　　结论：肿瘤转移是一个复杂的多步骤过程。许多基因和因素与肿瘤转移有关，但确切的分子机制仍不清楚。这项研究建立了具有强烈转移表型的转移性人胃癌小鼠模型，有助于了解该过程的分子机制。