抗幽门螺杆菌 中国实验动物信息网 2021-07-14 1561

　　确定是否可以获得经批准的个人使用的对幽门螺杆菌的全身免疫。在幽门螺杆菌感染的小鼠模型中评估了结合幽门螺杆菌抗原和氢氧化铝 (AlOH3) 的疫苗的功效。抗原和 -AlOH3 免疫可诱导白细胞介素 5 分泌、抗原特异性 T 细胞和免疫抗原。 ELISPOT 确定，完全弗氏佐剂诱导 II 型干扰素分泌和抗原特异性 T 细胞。通过培养两个组织学胃活检标本来评估两种免疫反应的保护作用，因为在遇到幽门螺杆菌后没有确认细菌。防御机制不依赖于抗体，使用抗体缺陷型 MMT 小鼠（免疫球蛋白敲除小鼠）和免疫小鼠 CD4 + 脾脏 T 细胞足以将保护性免疫传递给免疫功能低下的受体。...这一结果表明，对于幽门螺杆菌疫苗的快速开发，存在替代方案或潜在的更多策略。

　　幽门螺杆菌，世界上*常见的病原体，是一种细胞外细菌，会感染胃黏膜，引起胃炎和消化性溃疡。一般认为传染病主要见于幼儿。因此，使用预防性疫苗可以预防婴儿感染幽门螺杆菌，并防止成人长期接种。疫苗接种策略主要是口服和鼻腔，以诱导粘膜免疫。这些免疫接种需要对人类使用不安全的细菌外毒素佐剂。*近有报道称全身免疫是诱导和保护小鼠幽门螺杆菌免疫的一种可能手段。作者提出了一种观点，即 Th1 型免疫反应、幽门螺杆菌相关反应相关的胃癌病理学的贡献是诱导免疫所必需的。该建议基于对免疫球蛋白 (IgG) 类别的分析，没有直接测量细胞因子。一些报告已经证实，这种保护可以通过 2 型免疫介导。使用肠外免疫佐剂研究这种更直接的方法，并使用 ELISPOT 方法进行检测。这会产生高度极化的 Th1 或 Th2 响应。本研究调查了氢氧化铝佐剂 (AlOH3) 的全身免疫是否可以在没有抗体的情况下诱导保护性 Th2CD4T 细胞介导的免疫。 AlOH3诱导免疫在幽门螺杆菌疫苗研制中具有很大优势。这是因为 AlOH3 被批准供人类使用。其安全性、稳定性和低成本可加速人类幽门螺杆菌的大规模开发和应用。

　　材料和方法：小鼠购自杰克逊实验室，并在没有特定病原体的情况下饲养。使用的小鼠是缺乏成熟 T 和 B 淋巴细胞的 C57BL/6 或 C57BL/6J-Rag1tm1Mom (rag1 /)，或缺乏成熟 B 细胞的 C57BL/6-Igh-6tm1Cgn (mMT)。也就是说，它不能产生抗体。

　　Bacteria H. felis 是我们实验室从猫胃活检标本中分离出来的。幽门螺杆菌菌株HPM6是从人胃活检标本中分离出来的，并在我们实验室通过小鼠长期传代进行了调整。通过cagA的PCR检测证实了HpM6、用 HpM6 接种 C57BL/6 小鼠可引起慢性感染，在 100染的小鼠中持续 12 个月。通过菌落形态、细胞形态、革兰氏染色、脲酶、过氧化氢酶、氧化酶等方面鉴定了两种螺杆菌。

　　细菌在固体培养基（血琼脂）上生长并悬浮在布氏肉汤培养基中。

　　小鼠免疫与通路：幽门螺杆菌裂解液，我们等人已经通过口服途径证明这是一种有效的实验疫苗抗原。卵清蛋白（OVA）是Sigma Chemical Co., Ltd.购自，AlOH3 购自 Pierce。完全弗氏佐剂 (CFA) 是将结核分枝杆菌 H37RA (Difco Laboratories) 与 1 mg/mL 混合制成不完全弗氏佐剂。抗原和佐剂按1:1水溶液混合，每只小鼠第0天腹腔注射抗原100mg和注射乳剂100ml。在第 28 天，通过胃插管通过 18 号针头通过管饲法口服含有 1 × 107 cfu 细菌的 0.5 mL 肉汤培养基。通过使用先前建立的生长曲线将光密度设置为 450 纳米来确定细菌的数量。作为一个分离株，H. felis 很难生长和繁殖。使用标准吸收值根据幽门螺杆菌的生长曲线确定，如其他文件所述。

　　疫苗滴度测量：28天后，小鼠通过组织银染感染幽门螺杆菌。通过二氧化碳法对动物实施安乐死。拉长的组织通过手术从十二指肠移至贲门。组织用 10醛缓冲液固定并进行组织学检查。每个小鼠样本的几个部分都用银染剂染色，以帮助从细菌位置和形态上区分幽门螺杆菌和 H. ferris。银染未在组织中检测到幽门螺杆菌，证实小鼠受到免疫保护。此外，胃活检标本是从感染了幽门螺杆菌的小鼠中培养出来的，并证实了细菌的存在。从胃窦中手术取出含有幽门螺杆菌的样本，并与 200 毫升肉汤培养基混合。将匀浆涂抹在 100 mL 含有 7血的培养基上。经过 96 次微需氧培养后，免疫防御由未经培养细菌免疫的小鼠样本决定。在细菌存在的情况下，幽门螺杆菌的菌落形态、革兰氏染色以及脲酶、过氧化氢酶和氧化酶的产生决定了细菌。 H.felis的培养不可靠，不能操作。 H.felis 成片生长，而不是独立生长。

　　病理评估：与其他文献类似，评估小鼠胃曲率的纵向截面的炎症强度。有些包括胃窦和胃底粘液腺的全长。幽门窦的炎症等级为0-3、眼底的炎症等级为1-10。每只小鼠的总分是线性范围的深度（焦点、多焦点、斑片状或弥漫性）（在浅表和/或基底层、粘膜下层或粘膜下层或肌肉层）和炎症浸润的特征。它是由浸润细胞类型的组织结构的变化定义的。

　　采用：小鼠T细胞CD4亚群柱试剂盒纯化CD4 T细胞，采用尾静脉法向小鼠注射1000万个细胞。这个数字已经建立并用于自身免疫领域的研究。

　　酶免疫分析 (ELISPOT) 从脾脏制备单细胞悬液。将 1 x 106 个细胞接种在含有或不含有幽门螺杆菌抗原的每孔含有 1 mM 谷氨酰胺的无血清 HL-1 培养基中。终浓度为 5 毫克/毫升。将这些培养物加入到酶结合免疫斑点板中，PBS 分别专门捕获干扰素或白细胞介素 5、R46-A2（4 毫克/毫升）或 TRFK5（5 毫克/毫升）。在室温下，细胞用含有 1血清白蛋白的 pbs 封闭 1 小时，并在开始 24 小时细胞培养之前用 PBS 洗脱细胞 4 次。然后通过洗脱方法去除细胞，加入作为IFN-g的1mg/mL XMG1.2-HRP和作为IL-5的4mg/mL TRFK4以监测抗体并孵育板。对于 IL-5、添加抗 IgG2a-HRP 并继续孵育 2 小时。通过添加 3-amino-9-ethyl-carbazole，您可以在平板中看到抗体。使用 Series 1 Immunospot Image Analyzer 评估结果。

　　统计分析：实验组间ELISPOT的分析通过方差分析确定。通过Fisher精确检验评估免疫小鼠的感染或非感染。

　　结果：幽门螺杆菌感染和免疫的小鼠模型使用人类病原体或从猫身上分离出来的H. felis。与幽门螺杆菌不同，使用 C57BL/6 小鼠，H. felis 引起小鼠胃黏膜的炎症性病变，类似于人类胃炎。此外，根据小鼠胃的组织切片，H. felis 有更严重的感染。与幽门螺杆菌不同，它主要位于眼底交界处。它主要在胃窦和胃底生长和再生。用猫 H. felis 或幽门螺杆菌抗原和氢氧化铝 AlOH3 或完全弗氏佐剂 CFA 乳化剂免疫 C57BL/6 小鼠。我们*近的研究表明，这些佐剂可能会引发 2 型和 1 型免疫反应。 14 天后，通过使用酶结合免疫斑点试验 (ELISPOT) 测量 1 型和 2 型细胞因子（分别为 IFN-γ、IL-5），这些小鼠的脾细胞具有幽门螺杆菌抗原特异性。回复。对抗原免疫并用氢氧化铝乳化的小鼠细胞可能会产生缺乏 IFN-r 的 IL-5、产生IL-5的细胞数高于抗原特异性IFN-r数，两者均通过幽门螺杆菌免疫。抗原。用抗原和完全弗氏佐剂组免疫后，观察到相反数量的细胞因子，即IFN-r高。此外，用完全弗氏佐剂CFA免疫的小鼠血清也具有较高的IgG2a抗体滴度。在抗原乳化剂的情况下，氢氧化铝诱导的 2 型免疫反应是完全弗氏佐剂刺激的 1 型免疫反应，基于产生的细胞的相对数量和这些抗体亚型的免疫反应的分布。接下来，我们测试了 2 型或 1 型幽门螺杆菌抗原免疫的诱导是否可以保护肠粘膜免受幽门螺杆菌感染。 C57BL/6小鼠用氢氧化铝或完全弗氏佐剂乳化的幽门螺杆菌或猫肝菌免疫。对照组小鼠的可注射佐剂含有不相关的对照蛋白、卵清蛋白，或保持未免疫。 28天和28天后，灌胃口服1×107幽门螺杆菌，胃黏膜银染目测菌数。幽门螺杆菌的存在与否由细菌培养法确定。在这项完全免疫的小鼠研究中，哪种佐剂可以提供非常好的保护作用并不重要。通过观察银染组织中没有幽门螺杆菌。

　　然而，14 只对照小鼠中有 12 只感染了幽门螺杆菌。将幽门螺杆菌注射到 8 只小鼠中的 7 只中。注射氢氧化铝后无感染。佐剂氢氧化铝和完全弗氏佐剂使用后的保护作用很重要。小鼠 H. felis 比幽门螺杆菌感染更严重。 29 只小鼠中有 28 只被感染，并且胃部有很强的细菌附着。每个胃平均有 86 个受感染的腺体。使用 H.feli 抗原氢氧化铝佐剂在小鼠中未检测到细菌。使用完全弗氏佐剂和幽门螺杆菌乳化剂也有保护作用（21 人中有 5 人被感染）。我们和其他研究发现，有效的粘膜疫苗接种策略需要使用霍乱毒素和佐剂。使用氢氧化铝和完全弗氏佐剂与抗原也与有效的粘膜疫苗接种策略有关。与在假免疫小鼠中使用完全弗氏佐剂的 H. felis 的少数乳化后感染相比，在氢氧化铝和 H. felis 后乳化免疫小鼠中未观察到细菌感染。诱导 1 型或 2 型免疫是针对幽门螺杆菌的粘膜免疫的替代方法。小鼠切片的HE染色显示，在用氢氧化铝或完全弗氏佐剂免疫后，小鼠在胃窦部和眼底黏膜中表现出相当的黏膜炎症。炎症程度 幽门螺杆菌致热源免疫引起的炎症特征和程度与先前研究的霍乱毒素佐剂免疫无显着差异。用氢氧化铝、弗氏完全佐剂和幽门螺杆菌抗原免疫的小鼠的平均眼底炎症分别为 7.2 + 0.9 和 7.4 + 0.7。用氢氧化铝、弗氏完全佐剂和幽门螺杆菌抗原免疫的小鼠的平均胃窦炎症分别为 2.0 + 0 和 2.1 + 0.6、在所有情况下，用幽门螺杆菌抗原免疫的小鼠比用卵清蛋白免疫的小鼠表现出更严重的炎症。在其他实验中也观察到了免疫后的这种类型的胃炎。可能是由于对幽门螺杆菌免疫记忆的二次免疫。

　　接下来，我们开始研究免疫后针对幽门螺杆菌的免疫系统。完全弗氏佐剂如霍乱毒素具有剧毒，不应用于人类。重点是氢氧化铝佐剂的使用。随后的实验使用小鼠-H.felis 模型。这种微生物在小鼠体内表现出比幽门螺杆菌更明显的炎症，并引起更严重的感染，因此在组织切片中很容易观察到。氢氧化铝 AlOH3 或卵清蛋白和猫猫抗原用于免疫小鼠同源 uMT（免疫球蛋白敲除小鼠）。免疫后是否可以提供保护性抗体。使用卵清蛋白对照组的所有八只免疫球蛋白敲除小鼠 uMT 都是 H.。猫胃内给药后，细菌被感染，细菌生长率高。然而，只有一种免疫球蛋白敲除小鼠 uMT 与氢氧化铝佐剂 H. felis 显示出强大的免疫防御。在完全免疫的 B6 小鼠中，这些炎症反应没有显着差异。用氢氧化铝和H. felis免疫后，胃窦炎症为7.8±0.6、眼底炎症为2.38±0.5、用卵清蛋白和氢氧化铝免疫后胃窦和胃底的炎症分别为 3.7 + 1.5 和 1.5 + 0.5、这与先前使用口服免疫球蛋白敲除小鼠 uMT 的结果一致。

　　这些实验表明接种疫苗后不需要抗体免疫。接下来，我们进行了一项实验，看看是否可以保护从接种疫苗的小鼠中纯化的 T 细胞不被收养。来自用H.felis和氢氧化铝、卵清蛋白和氢氧化铝、H.felis和完全弗氏佐剂免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞，用卵清蛋白和弗氏佐剂免疫后28天，C57BL/6小鼠的脾细胞和柱-纯化的 CD4T 细胞。

　　讨论：简而言之，使用氢氧化铝AlOH3作为全身免疫的佐剂已被证明能够诱导保护性小鼠对抗幽门螺杆菌和H.ferris，它们介导CD42细胞介导的免疫。这些发现可能会对人类幽门螺杆菌疫苗的开发产生直接影响。首先，这份报告强化了系统免疫的概念。经批准的用于人体的佐剂可能是一种可行的替代实验，用于通过口服诱导幽门螺杆菌的粘膜免疫。为了进一步支持这一点，在另一系列旨在研究亲本幽门螺杆菌免疫对新生儿的有效性的实验中，我们的成功和可重复性是基于皮下免疫获得保护性免疫的。 Guyetal *近报道了这一观点，他介绍了一种违反长期粘膜免疫原则的新型幽门螺杆菌疫苗接种。

　　其次，与 Gaieta 的发现相反，幽门螺杆菌需要 1 型免疫反应。我们的数据显示，2 型免疫反应与 1 型免疫反应一样重要，并且可能更有效地对抗幽门螺杆菌感染。氢氧化铝是人类唯一可用的佐剂，并且是引发 2 型免疫反应的佐剂。根据*近的一些报道，它可以保护宿主免受幽门螺杆菌的 2 型粘膜免疫。这包括口服霍乱毒素和其他引起 2 型或 2 型和 1 型混合反应的实验性免疫佐剂。